速发型超敏反应是临床上最为常见的一种超敏反应,发生过程可分为致敏阶段与发敏阶段。其中,致敏阶段是指机体对过敏原发生免疫应答,产生针对该过敏原的特异性抗体,发敏阶段是指过敏原再次进入致敏机体结合特异性抗体形成免疫复合物,诱发效应细胞释放组胺,白三烯,血小板活化因子,前列腺素等过敏介质,引起以血管通透性增加,粘液分泌亢进,平滑肌收缩为特点的系统性或局部功能障碍和组织损伤。目前两类动物实验模型已被广泛用于速发超敏反应的研究,分别是主动过敏及被动过敏模型。前者需要致敏过程,再次进入机体的抗原与机体主动产生的抗体结合触发过敏反应,而后者的构建只需将预先制备的抗体被动输注给机体后再给予抗原攻击,不需要机体免疫主动产生抗体的过程,故操作上相对简单,实验周期较短,便于研究发敏过程的效应机制。经典免疫学概念中引起Ⅰ型超敏反应即过敏症的抗体主要为IgE,随着越来越多的IgG型治疗性单抗已经或者即将进入临床,IgG抗体引发的速发型超敏反应受到关注,因为人们发现几乎所有的治疗性单抗均以过敏反应,尤其是速发超敏反应为主要的副反应,依抗体的不同其发生率为0.09-77%,其中尤以过敏性休克最为严重,且危及生命。目前有30余种治疗性单抗已经FDA批准使用,另有300余种单抗正在处于临床实验(clinical trials)。这就使如何预防或预测IgG型单抗诱发过敏反应成为单抗的筛选与临床应用的重要安全性评估指标之一与亟待解决的问题。目前的实验研究主要借助被动系统性过敏反应(Passivesystemic anaphylaxis, PSA)的动物模型来模拟这一临床常见的单抗输注所致的过敏性休克反应。至今,IgG过敏途径具体的的启动条件尚不清楚。值得注意的是,并非所有的IgG抗体-抗原复合物或IgG聚合物均能介导PSA。然而,此前并无报道明确何种类型的IgG型免疫复合物可以诱发PSA,亦未给出这类IgG型免疫复合物的特征与判断标准。并且,现有研究大多采用单一的抗原抗体复合物来诱发PSA,多采用DNP(二硝基苯),TNP(三硝基苯),青霉素等半抗原而非与临床关系密切的天然抗原,且主要关注于过敏反应的效应机制而非过敏反应的启动条件。因此,本研究采用由8种天然及重组抗原,27种相应抗体组成的36对IgG抗体-抗原复合物构建小鼠PSA模型,并以五种体内外实验来预测各个IgG抗体-抗原复合物是否能够介导PSA。已知,体内IgG型免疫复合物可以结合效应细胞表面FcyRIII及FcyRIV,促使靶细胞释放以血小板活化因子(PAF)为主的活性介质,引起血管通透性增加及血压下降等病理变化。然而,IgG过敏通路的效应细胞尚存巨大争议,不同的研究所证实的效应细胞类型主要包括：巨噬细胞,嗜碱性粒细胞,单核细胞及中性粒细胞。现有报道均采用相对单一的抗原抗体体系诱导系统性过敏反应,亦采用相对单一的小鼠品系构建被动过敏模型,各个研究报道所得出的结论之间相互排斥而不可并存。因此,本研究将采用4种天然及重组抗原,IgG1, IgG2a及IgG2b等亚型抗体所组成的6种抗原抗体复合物构建被动过敏模型,并在BalB/c及C57BL/6两种品系小鼠体内观察各个细胞类型在IgG通路过敏反应的地位。在对IgG过敏途径效应细胞研究的过程中,我们意外发现了淋巴细胞抗原6G (Lymphocyte antigen6G, Ly6G)一种尚未见报道的可溶性存在形式,并建立了可溶性Ly6G (Soluable Ly6G, sLy6G)的双夹心ELSIA检测体系并对其功能特性进行了初步的研究。需要指出的是,在具体的实验过程中采用的粒细胞分化抗原(Granulocyte-differentiation antigen, Grl)抗体anti-Grl能够识别淋巴细胞抗原6C (Lymphocyte antigen6C, Ly6C)及Ly6G的共同表位Grl,其中Ly6C分子量14-17KDa,主要表达于单核巨噬细胞表面；Ly6G分子量25KDa,主要表达于中性粒细胞表面。一、特定的IgG免疫复合物方可启动PSA—可介导过敏反应的抗体.抗原复合物(Anaphylaxis-inducing immune complexes, Ai-ICs)定义的确立前期工作曾获得的10株抗鸡卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)单抗,并以其中三株单抗(2C2,5G12,6H4)与OVA构建了PSA模型。本章工作发现具有单独致敏效应的2C2,5G12,6H4与1A6,5B8实际上只针对OVA (Sigma A5503)中混有的成分卵粘蛋白(Ovomucoid,OVM)。后续工作均分别以1001μg上述5株抗OVM抗体(2C2,5G12,6H4,1A6,5B8)和由金伯泉教授惠赠的2株OVM抗体(No.7,No.9)致敏,2小时后再给以10μg OVM攻击,发现只有2C2,5G12,6H4这三株抗体单独致敏具有致PSA效应,而使用上述不能与OVM构建被动过敏模型的4株单抗两两组合致敏后再给以OVM攻击,发现No.7+1A6, No.7+5B8, No.7+No.9这三种单抗组合致敏亦具有致PSA效应,其他三种单抗组合(No.9+1A6, No.9+5B8,1A6+5B8)则不具此效应。接下来,使用8种天然及重组蛋白抗原及27株相应的单抗所组成的36种IgG抗体-抗原复合物进行PSA模型的验证,发现其中14种IgG抗体-抗原复合物可以介导PSA,而其余22种IgG抗体-抗原复合物不具此效应。本章工作采用14种IgG抗体-抗原复合物成功构建了小鼠PSA模型,并证实仅有部分,而非全部的IgG抗体-抗原复合物可以介导PSA。因此,本研究把可介导PSA的IgG抗体-抗原复合物称为过敏症诱导复合物Ai-ICs (anaphylaxis-inducing immune complexes, Ai-ICs),以区别不能介导PSA的IgG抗体-抗原复合物即nAi-ICs (Non-anaphylaxis-inducing immune complexes, nAi-ICs)。二、Ai-ICs特性及其判定标准本章共采用四种体内外实验确定Ai-ICs的特性及其判定标准,旨在为治疗性抗体的安全性评价提供有效方法与指标。(1)组成Ai-ICs的抗原抗体可在体外构成双夹ELISA:发现能够形成Ai-ICs的OVM单抗及其组合均可在体外与OVM形成双夹心ELISA.经过对36对IgG抗体-抗原复合物进行双夹心ELISA的验证,发现能够形成Ai-ICs的单抗及其组合均能在体外与其相应抗原形成双夹心ELISA (14/36),而不能在体外形成双夹心ELISA的IgG抗体-抗原复合物均不能形成Ai-ICs (17/36),另外,亦有一小部分体外能够形成双夹心ELISA的IgG抗体-抗原复合物不能形成Ai-ICs(5/36),我们在正文中对此现象做了一定的分析。(2) Native-PAGE:选取部分体外制备的含OVM, HSA, AOPP, HbA2的ICs进行Native-PAGE,发现其中Ai-ICs均可形成低荷质比的高分子量条带,然而,部分能够形成双夹心ELISA的]Ai-ICs亦会出现相似条带,而不能形成双夹心ELISA的nAi-ICs则均未出现。(3)被动皮肤过敏反应(Passive cutaneous anaphylaxis, PC A):以单抗2C2-OVM确定并优化PCA实验条件,证明36对IgG抗体-抗原复合物中Ai-ICs均能介导PCA (14/36),而nAi-ICs均无此效应(22/36)。(4)引发中性粒细胞CD16/32表达下调：分别给以小鼠或其外周血2C2-OVM复合物刺激,发现体内外2C2-OVM均可介导中性粒细胞CD16/32表达下调,而且进一步证实2C2-OVM复合物亦可刺激人外周血中性粒细胞CD16及CD32表达下调。以36对IgG抗体-抗原复合物进行验证,发现体内外Ai-ICs刺激均可诱发中性粒细胞CD16/32表达下调(14/36),而nAi-ICs均无此效应(22/36)。此外,如在抗体筛选或研发阶段可进行单抗表位识别及组合测定。本部分工作证实单抗或单抗组合与抗原形成的Ai-ICs需具备识别多价抗原表位并形成cross-linking的基本条件,均可形成双夹心ELISA,于Native-PAGE出现高分子量条带,介导PCA,并在体内外触发中性粒细胞CD16/32表达下调。这部分工作可望为治疗性单抗研发及临床应用的安全性评估提供重要参考与标准。三、Ai-ICs诱发PSA的影响因素及IgG过敏途径机理的研究本章研究发现在IgG抗体存在的条件下,外周血瞬时抗原浓度影响PSA的发生及严重程度。具体表现为：给以小鼠静脉注射OVM后0,10,20分钟后再给以抗OVM抗体2C2静脉注射,小鼠PSA的症状随2C2注射时间的推移而减轻甚至不可观测。重组人血红蛋白zeta链(rHb zeta)与OVM相似,其在血浆不稳定存在且随其抗体组合3H9+4D11注射时间的推移PSA症状减轻。然而,在血浆中相对稳定的抗原HSA静脉注射后0,10,20分钟再给以抗体组合2E9+3A5注射,并未观测到明显的PSA症状程度变化。由此可见,不同的抗原在外周血中清除速率不同可能直接导致其在同一时间点的抗原浓度不同,进而影响被动抗体输入诱发的PSA发生及其严重程度。对于IgG过敏途径效应机理的研究主要着眼于对效应细胞及效应分子的探索。通过应用特异性抗体Mar-1, anti-Grl,氯化钆(GdCl3),脂质体,环磷酰胺分别清除嗜碱粒细胞、中性粒细胞及单核／巨噬细胞,或阻断其功能,证明巨噬细胞是IgG过敏途径的主要效应细胞,而清除嗜碱性粒细胞,中性粒细胞,单核细胞等各类血细胞则对PSA的发生与严重程度无明显影响。通过应用特异性受体拮抗剂CV-3988, Triprolidine,发现血小板活化因子(Platelet activating factor, PAF)而非组胺是IgG过敏途径的主要效应介质。亦证明补体C3基因敲除,脾切除不影响PSA的严重程度,而Syk拮抗剂BAY61-3606可以明显减轻PSA症状,说明IgG过敏途径不依赖补体C3及脾脏内的细胞,而Syk信号通路在其中发挥着重要作用。四、sLy6G的发现及检测体系的建立本部分工作主要基于对小鼠单核巨噬细胞功能研究中的一个意外发现：在以毒性脂质体清除与GdCl3抑制小鼠体内单核巨噬细胞后,发现小鼠全血中性粒细胞Grl染色下调,但其表面CDllb及CD16/32的染色不受影响。而体外给以脂质体的刺激则不影响全血中性粒细胞Grl染色,说明体内诱导Grl染色下调的效应并非脂质体与中性粒细胞的直接作用引发。将毒性脂质体与对照脂质体处理鼠的外周血混合进行Grl染色,发现混合血中性粒细胞呈均一化的Grl染色,并未出现高低两群不同Grl表达水平的中性粒细胞。洗去毒性脂质体处理鼠全血血浆而单独以血细胞进行Grl染色后,发现其中中性粒细胞Grl的染色恢复。上述现象高度提示毒性脂质体处理鼠血浆中的某种物质阻断了anti-Gr1与中性粒细胞表面的Grl结合。进而,我们采用Dot-blot及Western blot证明了可溶性Ly6G (soluble Ly6G, sLy6)的存在：毒性脂质体处理鼠血浆能够特异结合anti-Grl抗体,其条带约在25KDa。高度提示样品中存在可溶性Ly6G (soluble Ly6G, sLy6)。为能准确捕获sLy6G,我们以可结合Ly6G和Ly6C的anti-Gr1为捕获抗体,以anti-Ly6G单抗为检测抗体成功构建了毒性脂质体处理鼠血浆中可溶性Ly6G的双夹心ELISA检测体系。毒性脂质体处理鼠血浆与腹腔细胞的结合实验发现,sLy6G能够特异地结合腹腔巨噬细胞,且其在对照脂质体处理后的小鼠体内极不稳定,呈现出单核巨噬细胞依赖性的血浆清除。综上,本课题以36对IgG抗体-抗原复合物构建小鼠PSA模型,并在此基础上提出了IgG过敏途径的启动者-Ai-ICs的鉴定标准：可识别抗原分子表面多价表位的单抗或多株单抗混合物,即monoclonal cocktail,均可形成双夹心ELISA,于Native-PAGE出现高分子量条带,介导PCA,并在体内外触发中性粒细胞CD16/32表达下调。上述结果及其所用方法可望成为未来治疗性单抗研发及临床应用的安全性评估的标准。在相应抗体存在下,Ai-ICs能否触发PSA及其严重程度受外周血瞬时抗原浓度的影响。IgG过敏途径由Ai-ICs启动,以PAJF为主要效应介质,以巨噬细胞为主要的效应细胞,其发生过程不依赖全血白细胞,补体及完整脾脏的参与,而Syk信号通路在其中发挥着重要作用。在IgG过敏途径效应细胞的研究中,发现了一种目前从未报道过的中性粒细胞分化抗原Ly6G的可溶性存在形式并成功建立其双夹心ELISA检测体系。针对其功能特性的研究初步证实,可溶性Ly6G特异结合单核巨噬细胞且在正常小鼠呈现出单核巨噬细胞依赖的血浆清除。