凝乳酶是干酪和干酪素生产过程中的关键酶，按其来源可分为动物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。由于微生物资源丰富、生长周期短、受气候等因素限制小等特点，因而成为凝乳酶研究的热点。本研究从甘肃甘南牧区采集的土壤样品中分离筛选产凝乳酶细菌，对筛选得到的优良菌株进行了鉴定和诱变选育，然后对突变菌株的产酶条件和酶学特性进行了研究，并将凝乳酶应用于干酪素生产中，对其应用性能进行了评价。主要研究结果如下：1．甘南牧区产凝乳酶细菌的分离筛选采用改进的酪蛋白培养基，从甘南牧区采集的56个样品中共分离筛选得到6株产凝乳酶细菌，复筛得到一株凝乳活力高、蛋白水解力低的菌株GN4.1，在麸皮汁培养基中发酵48h，凝乳活力可达1011.6SU/mL，蛋白水解力为14.6U/mL。通过形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列同源分析将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。菌株的生物学特性研究表明，其最适生长温度为37℃，最适生长pH在7.0~8.0之间，为典型的好氧菌。菌株GN4.1在其对数生长前期凝乳活力很低，进入对数生长后期(18h)后凝乳活力迅速增加，蛋白酶的产生与凝乳酶基本同步。2．高产凝乳酶菌株的诱变选育通过试验确定的解淀粉芽孢杆菌紫外线诱变最佳处理时间为60s；硫酸二乙酯诱变的最佳处理时间为60min。紫外诱变后，经筛选得到的突变株UV-1凝乳活力提高了23.2%，水解活力降低了23.3%，凝乳活力与蛋白水解活力的比值比出发菌株提高了60.6%。以UV-1为出发菌株，进行硫酸二乙酯诱变后，筛选得到的突变株DES-6凝乳活力比原始菌株提高了40.2%，水解活力降低了22.39%，凝乳活力与蛋白水解活力的比值提高了81.32%。传代试验表明突变株DES-6遗传性稳定性良好。3．产酶条件的优化采用单因素试验对菌株DES-6产酶条件进行研究，结果表明：温度为37℃，摇床转速为230r/min，种龄为16h，装液量为60mL/250mL，接种量为3%时适宜于菌株产酶。培养基中麸皮汁的适宜浓度为18%，适宜的外加碳源为葡萄糖，外加氮源为脱脂乳粉，外加磷源为磷酸氢二钠。Plackett-Burman试验结果表明：发酵培养基中的麸皮汁浓度、脱脂乳粉添加量、Na2HPO4的效应为正值，说明它们的高水平对菌株产酶有促进作用；而葡萄糖浓度、FeSO47H2O、MgSO47H2O、MnSO47H2O和ZnSO47H2O等5个因素的效应为负值，说明其高水平对菌株产酶有抑制作用。对3个重要因素采用Box-Benhnken试验设计进行优化，优化后的培养基组分为：17.25%的麸皮汁、3.31%脱脂乳粉、5%葡萄糖、0.1%FeSO47H2O、0.1%MgSO47H2O、0.1%MnSO47H2O、0.1%ZnSO47H2O和1.52%Na2HPO4。验证试验结果表明，在优化后的培养基中，凝乳酶活力可以达到3326.7SU/mL，与理论预测值的相对误差为0.19%。4．凝乳酶的酶学特性SDS-PAGE得到解淀粉芽孢杆菌凝乳酶的分子量为56.1kDa。酶学特性研究表明：凝乳酶的最适作用温度为60℃，在35℃时相对稳定，在65℃下处理20min完全失活；酶的最适作用pH为5.5，在pH5.5~9.0范围内相对稳定。同时，酶的最适作用底物脱脂乳的浓度为5g/100mL；不同的金属离子对酶活性的影响不同。K+和Na+对凝乳酶活性的抑制作用较小，而且两者变化规律大致相同；Zn2+、Cu2+和Sn2+对凝乳酶活性都有一定的抑制，其中Zn2+抑制作用最弱，Cu2+的抑制作用次之，Sn2+的抑制作用最强。Mn2+对凝乳酶活性有明显的促进作用，Li+、Mg2+在低浓度下促进凝乳酶活性，随着浓度的增大，促进作用减弱而抑制作用增强。5．凝乳酶在干酪素生产中的应用以解淀粉芽孢杆菌凝乳酶为凝乳剂，首先采用单因素试验研究了凝乳温度、pH值和凝乳酶添加量对干酪素出品率的影响，然后通过Box-Benhnken设计进一步优化了细菌凝乳酶干酪素生产工艺参数。优化得到的最佳凝乳参数为：凝乳温度为36.5℃、凝乳pH6.2、每500g脱脂牛乳中加入细菌凝乳酶0.37mL。验证试验结果表明，在此条件下凝乳酶干酪素的出品率为3.53±0.02%。经理化检验、功能特性比较和红外光谱分析，采用解淀粉芽孢杆菌凝乳酶制得的干酪素与小牛皱胃酶干酪素品质差异不显著，说明解淀粉芽孢杆菌凝乳酶可作为小牛皱胃酶的替代品用于干酪素生产。