慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease COPD）在全世界范围内有很高的发病率和死亡率,是目前第三位的致死主因。长期吸烟是COPD发病的主要原因,除了吸烟,生物燃料烟雾和环境颗粒污染物长期吸入也会导致COPD。COPD特征性表现为气道重塑和肺气肿。气道重塑表现为气道基底细胞增殖异常,导致内膜增厚,气道腔狭窄;气道重塑还表现为气道基底细胞分化异常,出现为鳞状细胞化生,纤毛细胞减少,粘液细胞和粘液下腺增生,诱发粘液分泌增多,纤毛清除减少,使得粘液纤毛清除功能（Mucociliary Clearance,MCC）受损。纤毛细胞减少、纤毛数量减低、纤毛缩短以及纤毛摆动异常导致的纤毛功能降低在MCC受损机制中占很大比重。COPD的病理特征为慢性炎症,组织中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润,其中巨噬细胞数量最多。巨噬细胞是肺组织稳态的重要卫士,肺内巨噬细胞不仅可以吞噬、清除吸入的颗粒性病原物,处理并递呈抗原,产生细胞因子以启动适应性免疫,还在组织修复、维持组织内稳态等过程发挥不可或缺的作用。活化的巨噬细胞可以分泌多种趋化因子和细胞因子,包括诱导中性粒细胞和单核细胞进入肺内的CXCL8;诱导肺组织破坏形成肺气肿的基质金属蛋白酶（matrix metalloprotenase MMP）;还有参与组织修复、诱导组织重塑的TGF-β等,这些趋化因子和细胞因子在COPD形成中发挥重要作用。我们的研究中发现,香烟提取物作用于巨噬细胞可致骨形态生成蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2,BMP-2）升高。已知BMP-2属于TGF-β（transforming growth factor TGF）超家族,BMP活化的信号通路高度保守,从苍蝇到哺乳动物,对于多器官的发育具有重要作用。BMP信号对多能干细胞的更新和分化具有影响,比如肺发育过程中BMP信号缺陷会导致支气管肺发育不良、鼠神经上皮细胞BMP-2信号增强可以抑制神经元的分化。呼吸道上皮损伤后,具有干细胞特性的气道基底细胞通过不断增殖和分化补充损伤的呼吸道上皮细胞。由此推测BMP-2可能通过某种机制对呼吸道上皮细胞分化产生影响。本实验通过动物急慢性香烟暴露、细胞共培养等手段关注巨噬细胞对呼吸道上皮细胞分化的影响,并特别聚焦到巨噬细胞对呼吸道上皮细胞纤毛蛋白表达的影响以及骨形态生成蛋白-2在其中的作用,以间接了解巨噬细胞在COPD形成过程中对气道基底细胞分化所发挥的作用。第一部分急慢性香烟暴露对小鼠呼吸道上皮细胞分化及肺炎症细胞的影响目的:通过小鼠急慢性香烟暴露,观察香烟暴露对于小鼠呼吸道上皮分化的影响和对小鼠肺炎症细胞的影响。方法:1.小鼠大剂量香烟急性暴露1个月后,小鼠气管和肺提取RNA和蛋白,通过RT-PCR和WB检测小鼠气管纤毛细胞foxj1m RNA和β-tubulin-Ⅵ蛋白,肺组织粘液细胞muc5ac m RNA和muc5ac蛋白、及Clara细胞scgb1a1m RNA和CCSP蛋白表达情况;小鼠新鲜肺组织制备单细胞悬液,通过荧光抗体孵育,行流式分析检测CD3+CD8+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD4+CD25+Fox P3+Treg细胞的比例;小鼠肺组织切片免疫组化染色检测CD68+巨噬细胞数量。2.小鼠慢性香烟暴露持续4个月,制作小鼠COPD模型,小鼠气管、肺组织提取RNA和蛋白,通过RT-PCR和WB检测小鼠气管纤毛细胞foxj1m RNA和β-tubulin-Ⅵ蛋白,肺组织粘液细胞muc5ac m RNA和muc5ac蛋白、及Clara细胞scgb1a1m RNA和CCSP蛋白表达情况;小鼠气管组织切片免疫荧光染色检测β-tubulin-Ⅵ蛋白和CCSP蛋白表达情况。小鼠新鲜肺组织制备单细胞悬液,通过荧光抗体孵育,行流式分析检测CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞的比例,小鼠肺组织切片免疫组化染色检测CD68+巨噬细胞数量。结果:1急性香烟暴露对小鼠呼吸道上皮细胞分化和炎症的影响1.1急性香烟暴露对小鼠肺炎症细胞的影响1.1.1急性香烟暴露导致小鼠肺组织巨噬细胞增多:小鼠大剂量香烟急性暴露1个月后,同正常组相比,香烟暴露组肺组织流式分析显示CD11b+F4/80+巨噬细胞比例增高和肺组织IHC染色显示CD68阳性巨噬细胞增多（P<0.05）。1.1.2小鼠急性香烟暴露后肺内CD3+CD4+T淋巴细胞增多:小鼠急性香烟暴露1个月后,同正常组相比,香烟暴露组的肺组织流式分析显示CD3+CD4+T淋巴细胞增高（P<0.05）。1.2急性香烟暴露对小鼠呼吸道上皮细胞分化的影响1.2.1急性香烟暴露导致小鼠气管纤毛细胞减少:小鼠急性香烟暴露1个月后,较正常组小鼠相比,香烟暴露组气管组织foxj1 m RNA和β-tubulin-Ⅵ蛋白表达明显减低（P<0.05）。1.2.2急性香烟暴露导致小鼠肺组织粘液细胞增加:小鼠急性香烟暴露1个月后,同正常组相比,香烟暴露组的肺组织muc5ac m RNA和muc5ac蛋白表达水平明显增高（P<0.05）。1.2.3急性香烟暴露后小鼠肺组织Clara细胞无明显变化:小鼠急性香烟暴露1个月后,较正常组相比,香烟暴露组的肺组织scgb1a1m RNA和CCSP蛋白表达无明显变化。2慢性香烟暴露对小鼠呼吸道上皮细胞细胞分化和炎症细胞的影响2.1慢性香烟暴露对小鼠肺组织炎症细胞的影响2.1.1慢性香烟暴露4个月导致小鼠肺气肿形成:小鼠慢性香烟暴露4个月后,正常组肺组织有少量肺泡破坏,肺泡平均截距为30.34±0.44um;香烟暴露组小气道完整性破坏增多,肺泡结构破坏严重,肺泡融合明显,肺泡平均截距为38.20±0.40um,较正常组明显增加（P<0.0001）。2.1.2慢性香烟暴露后小鼠肺巨噬细胞增多:小鼠慢性香烟暴露4个月,同正常组相比,香烟暴露组肺内CD68阳性巨噬细胞明显增多（P<0.05）2.1.3慢性香烟暴露后小鼠肺淋巴细胞减少:小鼠慢性香烟暴露4个月后,同正常组相比,肺组织流式分析显示香烟暴露组的肺组织CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、以及CD4+CD25+Fox P3+Treg淋巴细胞比例皆明显下降（P<0.05）（Fig.8）。2.2慢性香烟暴露对小鼠呼吸道上皮细胞分化的影响2.2.1慢性香烟暴露导致小鼠气管纤毛细胞减少:小鼠慢性香烟暴露4个月后,较正常组相比,香烟暴露组气管组织foxj1 m RNA和纤毛蛋白β-tubulin-Ⅵ表达减低（P<0.05）;气管组织切片IF染色显示纤毛蛋白阳性细胞比例明显减低（P<0.05）2.2.2慢性香烟暴露导致小鼠肺粘液细胞增多:小鼠慢性香烟暴露4个月后,较正常组相比,香烟暴露组肺组织muc5ac m RNA表达水平和muc5ac蛋白表达水平皆明显增高（P<0.05）。2.2.3慢性香烟暴露导致小鼠气管Clara细胞增加:小鼠慢性香烟暴露4个月后,较正常组相比,香烟暴露组气管组织scgb1a1m RNA表达水平明显增高（P<0.05）。气管组织切片IF染色显示CCSP蛋白阳性细胞比例明显增高（P<0.05）。小结:1.急性香烟暴露导致小鼠气管纤毛细胞减少,肺组织粘液细胞增多,肺组织巨噬细胞和CD3+CD4+T淋巴细胞增多。2.长期慢性香烟暴露导致鼠气管纤毛细胞减少、Clara细胞增多,肺组织粘液细胞增多;肺组织巨噬细胞增多,淋巴细胞细胞明显减低。第二部分香烟提取物刺激后巨噬细胞对呼吸道上皮细胞纤毛蛋白表达的影响目的:通过细胞实验观察香烟提取物、巨噬细胞细胞对呼吸道上皮细胞纤毛蛋白表达的影响。高通量测序筛选共培养状态下巨噬细胞细胞分泌可能对纤毛蛋白表达有影响的细胞因子。方法:1.Beas-2B细胞培养过程中加入不同浓度的香烟提取物,观察香烟提取物对于纤毛蛋白β-tubulin-Ⅳ表达的影响;2.Thp-1与Beas-2B细胞在transwell共培养,加入或不加香烟提取物,观察Thp-1细胞对Beas-2B细胞纤毛蛋白β-tubulin-Ⅳ表达的影响。3.取不同刺激条件下Thp-1细胞做m RNA进行高通量测序,筛选可能对Beas-2B细胞纤毛蛋白β-tubulin-Ⅳ表达有影响的细胞因子。结果:1不同浓度的香烟提取物对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达影响不同:0.25%香烟提取物使Beas-2B细胞纤毛蛋白表达增高,而1%香烟提取物使Beas-2B细胞纤毛蛋白表达减低。2 Thp-1细胞对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达的影响:2.1有或无CSE刺激时,Thp-1细胞均对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达有抑制作用:Thp-1细胞与Beas-2B细胞共培养,Thp-1细胞可以抑制Beas-2B细胞纤毛蛋白表达;共培养时加入CSE刺激后,Thp-1细胞对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达抑制作用增强。2.2 Thp-1细胞对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达的抑制作用呈浓度依赖性:Beas-2B细胞与Thp-1细胞在CSE刺激下共培养,Thp-1细胞会抑制Beas-2B细胞纤毛蛋白的表达。这种抑制作用随着Thp-1细胞数量增多而进一步增强。3高通量测序结果分析结合文献查阅推测Thp-1细胞分泌的BMP-2可能影响Beas-2B细胞纤毛蛋白表达。小结:1.0.25%香烟提取物增强Beas-2B细胞纤毛蛋白表达,1%香烟提取物作用相反。2.Thp-1细胞可以抑制Beas-2B细胞纤毛蛋白表达,香烟提取物刺激后抑制作用增强。3.高通量测序结果分析结合文献查阅推测Thp-1细胞分泌的BMP-2可能影响Beas-2B细胞纤毛蛋白表达。第三部分香烟提取物刺激后BMP-2对呼吸道上皮细胞纤毛蛋白表达的影响目的:通过外源性加入重组人BMP-2蛋白、应用BMP受体抑制剂LDN和在Thp-1细胞干扰BMP-2蛋白合成和分泌,以明确BMP-2对Beas-2B细胞纤毛蛋白β-tubulin-Ⅳ表达的影响。方法:1.Beas-2B细胞在香烟提取物刺激时加入不同浓度重组人BMP-2蛋白,观察后者对Beas-2B细胞纤毛蛋白β-tubulin-Ⅳ表达的影响。2.有或无香烟提取物刺激时重组人BMP-2蛋白对Beas-2B细胞纤毛蛋白β-tubulin-Ⅳ表达的影响。3.Beas-2B细胞培养时预先加入不同浓度BMP受体抑制剂LDN处理24小时,而后加入重组人BMP-2蛋白和香烟提取物,观察BMP受体阻断对Beas-2B细胞纤毛蛋白β-tubulin-Ⅳ表达的影响。4.Beas-2B细胞用LDN预处理24小时阻断BMP受体,然后与Thp-1细胞共培养并加入香烟提取物,观察Thp-1细胞对于Beas-2B细胞纤毛蛋白β-tubulin-Ⅳ表达的影响5.用BMP-2 si RNA干扰Thp-1细胞24小时后,然后与Beas-2B共培养并加入香烟提取物,观察干扰后Thp-1细胞对Beas-2B细胞纤毛蛋白β-tubulin-Ⅳ表达的影响。结果:1去除巨噬细胞因素,CSE刺激时,外源性加入重组人BMP-2蛋白对Beas-2B纤毛蛋白表达的影响1.1 CSE刺激时重组人BMP-2蛋白对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达具有抑制作用,这种抑制作用呈浓度依赖性:CSE刺激时,加入重组人BMP-2蛋白可以抑制Beas-2B细胞纤毛蛋白的表达。这种抑制作用随着重组人BMP-2蛋白剂量加大,抑制作用逐步增强。1.2有无CSE刺激,重组人BMP-2蛋白Beas-2B细胞纤毛蛋白表达的影响不同:没有CSE刺激时,50ng/ml重组人BMP-2蛋白对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达影响不明显;CSE刺激时,50ng/ml重组人BMP-2蛋白可以明显抑制Beas-2B细胞纤毛蛋白表达。2 CSE刺激时,BMP信号抑制后,Thp-1细胞对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达的影响2.1 BMP受体抑制剂LDN可以阻断重组人BMP-2蛋白在CSE刺激时对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达的抑制作用:CSE刺激时,重组人BMP-2蛋白可以使Beas-2B细胞纤毛蛋白表达明显减低;加入CSE和重组人BMP-2蛋白之前,用不同浓度BMP受体抑制剂LDN预处理Beas-2B细胞24小时,可以阻断重组人BMP-2蛋白对Beas-2B纤毛蛋白表达的抑制作用。2.2 BMP受体抑制剂LDN可以部分阻断CSE刺激时Thp-1细胞对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达的抑制作用:CSE刺激时,Thp-1细胞与Beas-2B细胞共培养,Thp-1细胞可以明显抑制Beas-2B细胞的纤毛蛋白表达。CSE刺激和共培养之前,用BMP受体抑制剂LDN预处理Beas-2B细胞24小时,则可以部分阻断Thp-1细胞对于Beas-2B细胞纤毛蛋白表达的抑制作用。2.3 BMP-2 si RNA干扰Thp-1细胞,可以部分阻断CSE刺激时Thp-1细胞对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达的抑制作用:CSE刺激时,Thp-1细胞可以抑制Beas-2B细胞纤毛蛋白的表达;CSE刺激和共培养之前,用BMP-2si RNA干扰Thp-1细胞24小时,可以部分阻断Thp-1细胞对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达抑制作用。小结:1.香烟提取物刺激时重组人BMP-2蛋白浓度依赖性的使Beas-2B细胞纤毛蛋白表达减低;2.利用BMP受体抑制剂LDN预处理Beas-2B细胞或是用BMP-2si RNA干扰Thp-1细胞,都可以部分阻断香烟提取物刺激时Thp-1细胞对Beas-2B细胞纤毛蛋白表达的抑制作用。结论:1.急性或慢性香烟暴露都可以导致小鼠肺内巨噬细胞增加,小鼠气道纤毛细胞减少、肺组织粘液细胞增多。2.0.25%香烟提取物可以使呼吸道上皮细胞纤毛蛋白表达增高,而1%香烟提取物作用相反。3.巨噬细胞可以抑制呼吸道上皮细胞纤毛蛋白表达;香烟提取物加强巨噬细胞对纤毛蛋白的抑制作用。4.BMP信号抑制可以部分阻断香烟提取物刺激时巨噬细胞对呼吸道上皮纤毛蛋白表达的抑制作用。5.香烟提取物刺激后,巨噬细胞可能通过BMP-2的作用影响呼吸道上皮细胞纤毛蛋白的表达。