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一、背景和目的
大肠埃希菌是人类肠道正常菌群之一，也是条件致病菌，一些特殊血清型的大肠埃希菌对人和动物有致病性，可引起肠道内感染导致腹泻。大肠埃希菌亦可引起肠道外感染，其中引起尿路感染的菌株被称为尿路致病性大肠埃希菌(uropathogenic Escherichia coli，UPEC)。
因为UPEC拥有独特的毒力因子，如粘附因子可以帮助细菌粘附宿主泌尿道上皮细胞，α溶血素和细胞毒性坏死因子1可以损伤杀死其粘附的宿主细胞，造成更大的感染扩散[1]，并且UPEC比肠道致病性大肠埃希菌有更大的遗传和表型变异性[2]，故使其成为尿路感染最常见的致病菌。另一方面，细菌生物膜的形成，有助于增强病原菌对抗菌药物和宿主免疫应答的抵抗能力。多聚磷酸盐(Poly-phosphate,Poly P)是细菌生存代谢活动中一个重要的因子，它是由高能磷酸酐键将数十至数百个磷酸盐残基连接而成的线性聚合物。研究发现PolyP参与细菌的致病过程，也能帮助细菌抵抗环境压力、逃避宿主免疫杀伤[3]，及调控耐药性相关调节子的表达增强细菌的耐药性[4]。在大肠埃希菌中PPK1(polyphosphate kinase 1,PPK1)是PolyP主要的代谢酶之一，它通过可逆性地催化ATP末端脱磷酸残基而合成长链PolyP。不少研究者认为PPK1或其编码基因ppk1将会成为新的抗菌药物的作用靶点。虽然PPK1作为细菌的毒力因子已经被证实，但是PPK1在UPEC的生存代谢及致病过程中发挥的作用仍然不清楚，所以本课题将通过表型实验和分子生物学实验探究ppk1基因在UPEC抗氧化能力、生物被膜形成能力和抵抗抗菌药物能力中发挥的作用及其作用机制，这将给后续以PPK1为靶向研发新的抗菌药物或者酶抑制剂提供重要的实验证据。
二、方法
(一)ppk1基因缺失对尿路致病性大肠埃希菌抗氧化能力及药物敏感性的影响
1.菌株：尿路致病性大肠埃希菌野生株CFT073、CFT073敲除ppk1基因构建的敲除株△pk1、△pk1回补ppk1基因构建的回补株△pk1-C。
2.采用过氧化氢分别刺激CFT073、△pk1及△pk1-C，不同刺激时间点菌落数除以刺激前的菌落数计算出生存率，比较三者的抗氧化能力。
3.采用结晶紫染色法检测CFT073、△pk1及△pk1-C不同时间点生物被膜的形成能力。
4.分别使用纸片扩散法和微量肉汤稀释法检测CFT073、△pk1及△pk1-C对抗菌药物的敏感性。
(二)ppk1基因在尿路致病性大肠埃希菌抗氧化能力及药物敏感性中的作用机制
1.将CFT073和△pk1菌体蛋白进行双向电泳与质谱分析，通过数据库比对确定差异蛋白质的信息。
2.实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)对CFT073和△pk1的抗氧化相关基因katG和katE进行定量分析。
3.实时荧光定量PCR法对CFT073和△pk1的耐药相关基因进行定量分析。
4.实时荧光定量PCR法对使用β-内酰胺类药物刺激的CFT073和△pk1的耐药相关基因进行定量分析。
三、结果
(一)ppk1基因缺失对尿路致病性大肠埃希菌抗氧化能力及药物敏感性的影响
1.采用过氧化氢刺激菌株后，与CFT073相比，△pk1在各时间点的生存率降低(P＜0.05),△pk1-C生存率基本一致(P＞0.05)。
2.利用结晶紫染色法检测各菌株生物被膜形成能力，结果显示10-24h之间△pk1生物被膜形成能力比CFT073的弱(P＜0.05)。各时间段△pk1-C与CFT073生物膜形成能力接近。
3.纸片扩散法和微量肉汤稀释法检测各菌株的药物敏感性，与CFT073相比，两种方法结果均显示△pk1对头孢噻肟、哌拉西林、他唑巴坦、氯霉素、呋喃妥因、磺胺甲恶唑和多粘菌素B的敏感性增强，而△pk1-C的敏感性无差异。
(二)ppk1基因在尿路致病性大肠埃希菌抗氧化能力及药物敏感性中的作用机制
1.蛋白质质谱分析成功鉴定出7个差异蛋白质，其中HPI、MarC、ArnA在△PK1的表达下调，饥饿时期DNA保护蛋白的表达上调。
2.实时荧光定量PCR检测结果显示抗氧化相关基因katG、katE在△pk1的表达量均比CFT073下调(**P＜0.01)。
3.实时荧光定量PCR检测耐药相关基因在CFT073和△pk1的表达水平，结果显示ompF在△pk1中的表达明显上调，ompC、ompA、mdtA、mdtG、marB、marC和pmrD在△pk1中的表达相对下调，ompW和tolC在两菌株中的表达无差异。
4.经哌拉西林刺激后，CFT073株ompA、ompW、和tolC基因的表达量升高，△pk1的无统计学差异；经头孢噻肟刺激后，CFT073株ompA、ompW、和tolC基因的表达量升高，△pk1的无统计学差异。
四、结论
1.ppk1基因的缺失使UPEC抗氧化压力能力下降，生物被膜形成能力减弱，对某些抗生素的耐药性降低。
2.ppk1基因可能参与调控UPEC中抗氧化相关基因katG、katE的表达，使katG基因编码的HPI表达增加。
3.ppk1基因可以影响UPEC耐药性相关蛋白及基因的表达。
大肠埃希菌是人类肠道正常菌群之一，也是条件致病菌，一些特殊血清型的大肠埃希菌对人和动物有致病性，可引起肠道内感染导致腹泻。大肠埃希菌亦可引起肠道外感染，其中引起尿路感染的菌株被称为尿路致病性大肠埃希菌(uropathogenic Escherichia coli，UPEC)。
因为UPEC拥有独特的毒力因子，如粘附因子可以帮助细菌粘附宿主泌尿道上皮细胞，α溶血素和细胞毒性坏死因子1可以损伤杀死其粘附的宿主细胞，造成更大的感染扩散[1]，并且UPEC比肠道致病性大肠埃希菌有更大的遗传和表型变异性[2]，故使其成为尿路感染最常见的致病菌。另一方面，细菌生物膜的形成，有助于增强病原菌对抗菌药物和宿主免疫应答的抵抗能力。多聚磷酸盐(Poly-phosphate,Poly P)是细菌生存代谢活动中一个重要的因子，它是由高能磷酸酐键将数十至数百个磷酸盐残基连接而成的线性聚合物。研究发现PolyP参与细菌的致病过程，也能帮助细菌抵抗环境压力、逃避宿主免疫杀伤[3]，及调控耐药性相关调节子的表达增强细菌的耐药性[4]。在大肠埃希菌中PPK1(polyphosphate kinase 1,PPK1)是PolyP主要的代谢酶之一，它通过可逆性地催化ATP末端脱磷酸残基而合成长链PolyP。不少研究者认为PPK1或其编码基因ppk1将会成为新的抗菌药物的作用靶点。虽然PPK1作为细菌的毒力因子已经被证实，但是PPK1在UPEC的生存代谢及致病过程中发挥的作用仍然不清楚，所以本课题将通过表型实验和分子生物学实验探究ppk1基因在UPEC抗氧化能力、生物被膜形成能力和抵抗抗菌药物能力中发挥的作用及其作用机制，这将给后续以PPK1为靶向研发新的抗菌药物或者酶抑制剂提供重要的实验证据。
二、方法
(一)ppk1基因缺失对尿路致病性大肠埃希菌抗氧化能力及药物敏感性的影响
1.菌株：尿路致病性大肠埃希菌野生株CFT073、CFT073敲除ppk1基因构建的敲除株△pk1、△pk1回补ppk1基因构建的回补株△pk1-C。
2.采用过氧化氢分别刺激CFT073、△pk1及△pk1-C，不同刺激时间点菌落数除以刺激前的菌落数计算出生存率，比较三者的抗氧化能力。
3.采用结晶紫染色法检测CFT073、△pk1及△pk1-C不同时间点生物被膜的形成能力。
4.分别使用纸片扩散法和微量肉汤稀释法检测CFT073、△pk1及△pk1-C对抗菌药物的敏感性。
(二)ppk1基因在尿路致病性大肠埃希菌抗氧化能力及药物敏感性中的作用机制
1.将CFT073和△pk1菌体蛋白进行双向电泳与质谱分析，通过数据库比对确定差异蛋白质的信息。
2.实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)对CFT073和△pk1的抗氧化相关基因katG和katE进行定量分析。
3.实时荧光定量PCR法对CFT073和△pk1的耐药相关基因进行定量分析。
4.实时荧光定量PCR法对使用β-内酰胺类药物刺激的CFT073和△pk1的耐药相关基因进行定量分析。
三、结果
(一)ppk1基因缺失对尿路致病性大肠埃希菌抗氧化能力及药物敏感性的影响
1.采用过氧化氢刺激菌株后，与CFT073相比，△pk1在各时间点的生存率降低(P＜0.05),△pk1-C生存率基本一致(P＞0.05)。
2.利用结晶紫染色法检测各菌株生物被膜形成能力，结果显示10-24h之间△pk1生物被膜形成能力比CFT073的弱(P＜0.05)。各时间段△pk1-C与CFT073生物膜形成能力接近。
3.纸片扩散法和微量肉汤稀释法检测各菌株的药物敏感性，与CFT073相比，两种方法结果均显示△pk1对头孢噻肟、哌拉西林、他唑巴坦、氯霉素、呋喃妥因、磺胺甲恶唑和多粘菌素B的敏感性增强，而△pk1-C的敏感性无差异。
(二)ppk1基因在尿路致病性大肠埃希菌抗氧化能力及药物敏感性中的作用机制
1.蛋白质质谱分析成功鉴定出7个差异蛋白质，其中HPI、MarC、ArnA在△PK1的表达下调，饥饿时期DNA保护蛋白的表达上调。
2.实时荧光定量PCR检测结果显示抗氧化相关基因katG、katE在△pk1的表达量均比CFT073下调(**P＜0.01)。
3.实时荧光定量PCR检测耐药相关基因在CFT073和△pk1的表达水平，结果显示ompF在△pk1中的表达明显上调，ompC、ompA、mdtA、mdtG、marB、marC和pmrD在△pk1中的表达相对下调，ompW和tolC在两菌株中的表达无差异。
4.经哌拉西林刺激后，CFT073株ompA、ompW、和tolC基因的表达量升高，△pk1的无统计学差异；经头孢噻肟刺激后，CFT073株ompA、ompW、和tolC基因的表达量升高，△pk1的无统计学差异。
四、结论
1.ppk1基因的缺失使UPEC抗氧化压力能力下降，生物被膜形成能力减弱，对某些抗生素的耐药性降低。
2.ppk1基因可能参与调控UPEC中抗氧化相关基因katG、katE的表达，使katG基因编码的HPI表达增加。
3.ppk1基因可以影响UPEC耐药性相关蛋白及基因的表达。