论文部分内容阅读
枣（Ziziphus jujuba Mill.）是中国的优势果树，具有很高的经济价值。‘无核小枣’是天然存在的无核品种，其果核木质化程度低，食用或加工较为方便。枣果核即内果皮的主要成分是木质素，因此研究枣果实木质素合成途径中参与调控的关键酶基因对揭示‘无核小枣’果实无核现象具有重要意义。本研究以‘无核小枣’为试材，‘金丝小枣’作为对照，从其果实中克隆得到四个木质素合成关键酶基因的cDNA序列，并研究了不同发育时期四个基因的表达情况。主要研究结果如下:
1.枣木质素合成关键酶基因的克隆及序列分析
以‘金丝小枣’和‘无核小枣’的cDNA序列为模板，应用RT-PCR技术克隆得到了二者香豆酸-3-羟基化酶(C3H)，肉桂酸4-羟基裂解酶(C4H)，肉桂醇脱氢酶（CAD）和咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(CCoAOMT)的基因序列，并进行生物信息学分析。
‘金丝小枣’和‘无核小枣’的C3H基因的开放阅读框序列一致，长度为1569bp，编码522个氨基酸。基因组序列含有2个外显子和1个内含子。二者的C3H蛋白属于细胞色素P450家族。均为稳定蛋白，亲水性蛋白。二者在系统进化树中与黄连的亲缘关系最近。
‘金丝小枣’和‘无核小枣’C4H基因的开放阅读框序列不一致，存在4个差异碱基，2个差异氨基酸分别位于第196位(D-N)，491位(P-H)。二者的开放阅读框长度为1518bp，编码505个氨基酸。基因组序列包含3个外显子和2个内含子。二者的C4H蛋白属于细胞色素P450家族。均为不稳定蛋白，亲水性蛋白。二者在系统进化树中与啤酒花的亲缘关系最近。
‘金丝小枣’和‘无核小枣’CAD基因的开放阅读框序列不一致，有5个差异碱基，1个差异氨基酸位于第314位(A-E)。二者的开放阅读框长度为984bp，编码327个氨基酸。基因组序列有6个外显子和5个内含子。二者的CAD蛋白均属于NADB-Rossmann家族。均为稳定蛋白，亲水性蛋白。二者在系统进化树中与梨、苹果和梅树的亲缘关系较近。
‘金丝小枣’和‘无核小枣’的CCoAOMT基因的开放阅读框序列一致，长度为744bp，编码247个氨基酸。基因组序列均含有5个外显子和4个内含子。二者的CCoAOMT蛋白均属于AdoMet MTases家族。均为稳定蛋白，亲水性蛋白。二者在系统进化树中与龙眼和橙的亲缘关系最近。
2.枣木质素合成关键酶基因表达研究
应用实时荧光定量PCR技术，研究了C3H，C4H，CAD和CCoAOMT基因在不同发育时期的‘金丝小枣’和‘无核小枣’果实中的表达情况。四个基因的相对表达量变化趋势较为一致，都是先上调然后下调，最后再上调。每个基因的表达量均存在差异，并且在‘无核小枣’中的表达量低于‘金丝小枣’。这四个基因的差异表达可能是‘无核小枣’果核木质化程度较低的原因。
1.枣木质素合成关键酶基因的克隆及序列分析
以‘金丝小枣’和‘无核小枣’的cDNA序列为模板，应用RT-PCR技术克隆得到了二者香豆酸-3-羟基化酶(C3H)，肉桂酸4-羟基裂解酶(C4H)，肉桂醇脱氢酶（CAD）和咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(CCoAOMT)的基因序列，并进行生物信息学分析。
‘金丝小枣’和‘无核小枣’的C3H基因的开放阅读框序列一致，长度为1569bp，编码522个氨基酸。基因组序列含有2个外显子和1个内含子。二者的C3H蛋白属于细胞色素P450家族。均为稳定蛋白，亲水性蛋白。二者在系统进化树中与黄连的亲缘关系最近。
‘金丝小枣’和‘无核小枣’C4H基因的开放阅读框序列不一致，存在4个差异碱基，2个差异氨基酸分别位于第196位(D-N)，491位(P-H)。二者的开放阅读框长度为1518bp，编码505个氨基酸。基因组序列包含3个外显子和2个内含子。二者的C4H蛋白属于细胞色素P450家族。均为不稳定蛋白，亲水性蛋白。二者在系统进化树中与啤酒花的亲缘关系最近。
‘金丝小枣’和‘无核小枣’CAD基因的开放阅读框序列不一致，有5个差异碱基，1个差异氨基酸位于第314位(A-E)。二者的开放阅读框长度为984bp，编码327个氨基酸。基因组序列有6个外显子和5个内含子。二者的CAD蛋白均属于NADB-Rossmann家族。均为稳定蛋白，亲水性蛋白。二者在系统进化树中与梨、苹果和梅树的亲缘关系较近。
‘金丝小枣’和‘无核小枣’的CCoAOMT基因的开放阅读框序列一致，长度为744bp，编码247个氨基酸。基因组序列均含有5个外显子和4个内含子。二者的CCoAOMT蛋白均属于AdoMet MTases家族。均为稳定蛋白，亲水性蛋白。二者在系统进化树中与龙眼和橙的亲缘关系最近。
2.枣木质素合成关键酶基因表达研究
应用实时荧光定量PCR技术，研究了C3H，C4H，CAD和CCoAOMT基因在不同发育时期的‘金丝小枣’和‘无核小枣’果实中的表达情况。四个基因的相对表达量变化趋势较为一致，都是先上调然后下调，最后再上调。每个基因的表达量均存在差异，并且在‘无核小枣’中的表达量低于‘金丝小枣’。这四个基因的差异表达可能是‘无核小枣’果核木质化程度较低的原因。