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本研究以核桃仁为原料提取蛋白,并用五种蛋白酶对其进行水解,制备核桃仁蛋白酶水解物,通过MTT细胞增殖分析实验,研究水解物对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响,并用流式细胞技术、激光共聚焦免疫荧光实验、免疫印迹等方法,对作用机理进行进一步研究。本项研究主要结果如下:1)用碱溶酸沉法提取核桃仁蛋白,并用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及中性蛋白酶等五种蛋白酶制备核桃仁蛋白酶水解物,通过MTT细胞增殖分析实验,研究核桃仁蛋白及其酶水解物对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响,结果表明核桃仁蛋白木瓜酶水解物具有明显的抑制细胞生长作用,IC50值为1.62 mg/mL,而核桃仁蛋白及其它四种蛋白酶水解物没有显示明显的抑制细胞生长作用。2)用MTT细胞增殖分析实验,研究核桃仁蛋白木瓜酶水解物对其它癌细胞及非肿瘤细胞增殖作用的影响。结果表明对人结肠癌细胞Caco-2及人宫颈癌细胞Hela也具有明显的抑制生长作用,IC50值分别为2.04 mg/mL和2.21 mg/mL。然而,对非肿瘤细胞大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6未显示明显的抑制生长作用。3)用核桃仁蛋白木瓜酶水解物处理MCF-7细胞,对其进行PI单染。用流式细胞仪检测细胞各周期DNA含量,结果显示亚G1期细胞数量增多,导致细胞周期紊乱,由未处理的对照组(0 mg/mL)的3.79%分别增大到7.67%(2 mg/mL)和18.24%(4 mg/mL),而细胞增殖指数PI分别降低为0.4321,0.3796(对照组PI为0.4561)。表明核桃仁蛋白木瓜酶水解物抑制MCF-7细胞增殖,使MCF-7细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期。4)Annexin V-FITC/PI双染和原位末端凋亡TUNEL实验结果表明,用浓度为2 mg/mL和4 mg/mL的核桃仁蛋白木瓜酶水解物处理MCF-7细胞后,细胞凋亡率分别为8.17%、18.11%。表明核桃仁蛋白木瓜酶水解物以浓度依赖的方式诱导MCF-7细胞凋亡。5)用免疫印迹技术检测与自噬相关蛋白LC3-II的表达,结果表明随样品浓度的增加,LC3-II蛋白表达水平越高。激光共聚焦免疫荧光实验结果显示,LC3-II在细胞质中表达(与阳性对照作用相当),表明核桃仁蛋白木瓜酶水解物同时也诱导MCF-7细胞自噬性死亡。以上研究结果表明,核桃仁蛋白中含有抑制癌细胞生长的成分,经木瓜酶水解后被释放,并通过诱导细胞凋亡与自噬,而抑制癌细胞生长。