丁醇是一种重要的有机原料和化工溶剂，亦是极具潜力的新型燃料。近年来，基于化石资源不可再生性的共识，生物法制造丁醇迅速成为新的研究热点。然而目前生物丁醇制造存在原料成本高、丁醇选择性差、时空效率低、后提取工艺繁杂耗能等诸多问题，严重降低了生物丁醇的生产效益。围绕这些问题，本文开展了相关研究并取得如下主要结果:　　1.针对ABE发酵溶剂质量得率低、丁醇选择性差的问题，在代谢网络分析的基础上重塑丙酮丁醇梭菌胞内电子传递链，显著降低了丙酮产量、提高了丁醇得率。　　构建了丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum) B3的代谢网络模型，并推算出表征辅因子流向与丁醇发酵产物选择性关系的定量方程，此方程揭示了代谢网络中当量还原力在氢化酶的作用下生成H2逸出是导致丁醇得率低下、氧化态产物大量产生的根本原因。选用电子载体甲基紫精(MV)将氢化酶节点处的FdH2转化至NAD(P)H后，ABE发酵过程的氢气产量下降48％，用于合成NAD(P)H的电子流量增加了一倍，胞内NAD(P)H水平提高，丙酮产量显著降低，丁醇得率提高37.8％，丁醇-丙酮之比由2.8提高至10.8。因此，弱化氢化酶对FdH2的氧化作用是提升ABE发酵中丁醇选择性的有效手段。研究采用了二型内含子插入技术失活C.acetobutylicum B3氢化酶基因hydA，然而虽经反复尝试却无法获得hydA插入失活的菌株。未来研究可在丙酮丁醇梭菌中发掘或构建FdH2至NADH的高效转化系统，这是在失活氢化酶无法取得理想效果的情况下可能最有希望的一点。　　2.针对丁醇发酵原料成本偏高、经济效益差的问题，基于丙酮丁醇梭菌发酵中乙偶姻与丙酮之间的竞争性产生关系，创造性地开展了以高值化学品乙偶姻取代丙酮联产丁醇的研究，成功将丁醇发酵的总产品价格提升了2倍。　　详细分析了丙酮丁醇梭菌乙偶姻合成基因的表达规律以及转录调控因子AlsR对乙偶姻合成的影响，鉴定出对乙偶姻产量有决定作用的关键基因——乙酰乳酸脱羧酶基因CAC2967。在C.acetobutylicum B3中过表达CAC2967后，丁醇发酵中乙偶姻产量由1.8提高至5.0 g/L，丙酮降低至2.2 g/L，而丁醇产量未受显著影响。进一步研究表明，在丙酮生成基因adc被失活的菌株中过表达CAC2967能够缓解酸的积累、改善发酵效果。经MV和CaCO3组合优化后，所得基因工程菌株最终发酵产物为:丁醇13.8 g/L，乙醇3.9 g/L，乙偶姻4.3 g/L，无丙酮。实现了以乙偶姻取代丙酮联产丁醇的目标，总产品得率提高8.5％，总产品价格提高2倍，显著提升了丁醇发酵的经济效益。　　3.针对丁醇发酵周期长、时空效率低的问题，开展了细胞吸附固定化研究，大幅提高了丙酮丁醇梭菌的丁醇耐受性和反应速率，将生物丁醇的溶剂生产强度提高了5倍。　　研究发现C.acetobutylicum B3经天然纤维材料CTF吸附固定化后，其丁醇耐受性和反应速率大幅提高，发酵周期由80 h左右降低至48 h左右，胞内ATP和NADH水平显著降低，代谢特性及发酵产物均发生了重要变化。实验考察了多种因素对固定化细胞发酵的影响，结果表明与游离细胞相比，固定化细胞发酵体系具有更好的稳定性。研究将吸附固定化细胞发酵工艺放大至2L自制不锈钢反应器中，并经过大量的实验进行工艺改进和填料优化，最终实现了反复批次发酵的长期运行，平均发酵周期仅12-14 h，为目前文献报道的最短丙酮丁醇梭菌批次发酵周期。经甲基紫精和玉米浆调控后，平均丁醇浓度高达15.6g/L，总溶剂22.5 g/L，生产强度1.88 g/L/h，溶剂得率0.38 g/g，在同类研究中整体竞争优势明显。　　4.针对生物丁醇制备浓度低、分离能耗高的问题，开展了新型反应—分离耦合技术的研究，采取吸附法将溶剂当量生产浓度提高了4-5倍，显著降低了产物回收能耗和废水量。　　将课题组自行设计的聚苯乙烯骨架大孔吸附树脂KA-I应用于丁醇发酵产物吸附分离过程中，结果表明KA-I在发酵过程中对丁醇有最大的吸附选择性（吸附容量90-110 mg/g树脂），丙酮其次，乙醇最小。KA-I具有不吸附乙酸、乙偶姻和葡萄糖的优点，但是对丁酸却有较强的吸附作用。研究考察了树脂用量、投加时间以及丁醇浓度对KA-I吸附分离性能及发酵效率的影响，并通过构建固定化细胞连续补料发酵——树脂同步吸附分离的集成过程同时将丁醇浓度维持在6.5g/L以上，有效控制了发酵过程中丁酸吸附量并显著降低了游离菌体浓度。经过丙酮共吸附和氧化还原调控后，ABE当量生产浓度达到96.5-130.7 g/L，溶剂生产强度为1.0-1.5 g/L/h，溶剂得率为0.36 g/g葡萄糖。此集成过程的当量溶剂生产浓度是传统发酵的4-5倍，为目前吸附法中最高浓度，最终丁醇解吸浓度50-60g/L（甲醇溶液），显著降低了生物丁醇提取工艺的废水和能耗。　　5.首次对吸附固定化丙酮丁醇梭菌全基因组转录进行了分析，明晰了其发生重大调整的代谢模块及相关基因表达行为的变化，为后续固定化细胞发酵体系的理性调控奠定了基础。　　固定化C.acetobutylicum B3全基因组约16％的基因的表达发生了显著差异，其中氨基酸代谢、无机离子转运和代谢、能量代谢、辅酶代谢四个COG分类的基因出现最为明显的表达差异。Fe摄取、硫摄取、半胱氨酸及甲硫氨酸合成基因被明显上调。hydA2和[NiFe]-氢化酶基因，阿拉伯糖、木糖等次级糖利用基因，PFK和部分PPP基因，以及孢子生成、淀粉合成、胞外聚合物降解等基因在发酵后期被显著上调。组氨酸合成基因被明显下调，在产酸期被下调130-700倍;硫胺合成途径在产溶剂后期被明显下调;精氨酸合成基因在产酸期被上调10-20倍。此外固氮基因、多肽转运基因、核黄素合成基因、色氨酸合成基因、支链氨基酸合成基因等也都在不同发酵时期被显著上调，而钴摄取及钴啉合成基因、多药抗性基因、嘧啶合成基因等总体呈现下调趋势。研究结果为深入理解和后续理性调控吸附固定化细胞发酵体系奠定了基础。