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人类的皮肤和毛发颜色是结构性着色和功能性着色的影响。结构性着色是受遗传基因控制的,不受外界环境的影响。而功能性着色的黑素合成水平则是在随环境的变化而发生相应的变化。目前研究认为黑素生物合成的主要限速酶是酪氨酸酶家族成员。其中酪氨酸酶(Tyr)是一种与铜离子结合的糖蛋白,而酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)是一种铁和锌结合糖蛋白。在皮肤黑素生物合成的过程中,酪氨酸羟化生成多巴,多巴氧化生成多巴醌,二羟基吲哚转化成吲哚醌,这些反应步骤均需酪氨酸酶的的参与。酪氨酸酶缺乏或者活性改变时,以上反应发生过程明显变慢。因此酪氨酸酶活性的改变可能引起白癜风的发病,而酪氨酸酶基因的突变也是白化病发病的重要原因之一。而TRP-1和TRP-2对黑素生成的数量和能力进行进一步的调控。TRP-1位于基因brown位点,TRP-2位于基因slaty位点,这些位点的改变都可以引起皮肤颜色的改变。TRP-1、TRP-2与TYR在结构上相似,并具有40%以上的同源氨基酸。由此推断,三者具有相同的原始基因,组成复合体在黑素合成过程中发挥作用。小眼畸形因子(MITF)是一个具HLHzip结构的核转录因子,近年来研究证实其在黑素细胞的发育、分化和功能调节中具有重要作用,被认为是一个新的黑素合成调节因子。MITF能与高度保守的M-BOX序列结合,激活多种参与黑素合成的酶,如TYR.TRP-1、TRP-2转录的调节,并且其自身的表达也同时受到多种转录因子的调控。同时,关于黑素合成的信号通路研究也一直是黑素细胞生物学作用的研究热点之一。早期的研究发现蛋白激酶A(PKA)途径和蛋白激酶C(PKC)途径在黑素合成中发挥重要的作用。近年来,研究证实PKA的激活可以启动MITF的转录活性,从而提高黑素的合成功能。这一作用可能机制是由于PKA途径被激活后,CREB磷酸化水平增高,修饰MITF的启动子而产生的。雌激素对皮肤角质形成细胞、成纤维细胞、黑素细胞以及皮脂腺等附属器的生理过程都有不同程度的调节作用,在皮肤老化、毛发生长、皮脂分泌甚至皮肤癌的发病中都起到重要的作用。在黑素瘤细胞和痣细胞上都被证实有雌激素受体的表达。早期的研究证明已经观察到雌激素能引起人类皮肤色素沉着,临床上也发现多例用性激素药物治疗白癜风有效的报道。由于作为内源性的生物活性物质——雌二醇(estrogen),极易氧化失活,而人工合成雌激素己烯雌酚(Diethylstilbe-strol)比天然雌激素更易于体内的雌激素受体结合发挥作用,并具有雌二醇所有的药理作用。因此我们选择人工合成的雌激素——己烯雌酚作为本课题研究药物。本课题拟观察己烯雌酚对黑色素瘤细胞黑素合成的影响,并进一步探讨其作用与cAMP-MITF-酪氨酸酶通路的关系。本课题分为以下三个部分：第一部分己烯雌酚对小鼠黑素瘤细胞B16黑素合成的影响。方法：选择10-9μM、10-8μM、10-7μM、10-6μM、10-5μM、10-4μM、10-3μM浓度的己烯雌酚分别作用于黑素瘤细胞24h、48h、72h,用噻唑蓝比色法(MTT比色法)测定细胞的活性。然后,根据MTT结果,选取不同浓度的己烯雌酚作用于黑素瘤细胞,NaOH溶解法检测其作用24h后黑素合成作用。同时选取其中一个浓度检测药物作用24h,48h,72h后黑素合成量。结果：己烯雌酚在10-8-10-3μM浓度促进黑素瘤细胞的增殖(p<0.01)。而这一作用在10-4μM时最为明显,与10-3uM浓度组比较无统计学意义(p>0.05)。24h,48h,72h三个时间点,己烯雌酚对黑素瘤细胞的促增殖作用无明显统计学差异(p>0.05)。选取10-6μM、10-5μM、10-4μM、10-3μM浓度的己烯雌酚干预后,黑素合成检测结果显示,己烯雌酚对黑素合成有促进作用,并呈浓度依赖。而24h,48h,72h三个时间点,10-3μM己烯雌酚对黑素合成的影响无明显统计学差异(p>0.05)结论：己烯雌酚对黑素合成有上调作用,并呈浓度依赖性。第二部分己烯雌酚促黑素合成作用涉及调节酪氨酸酶家族方法：用10-6μM、10-5μM、10-4μM、10-3μM四个浓度的己烯雌酚分别作用于黑素瘤细胞24h后,检测其酪氨酸酶活性。同时应用半定量RT-PCR和Western blot的方法,检测不同浓度下己烯雌酚对TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA转录和相应蛋白的表达。结果：己烯雌酚对酪氨酸酶活性有上调作用并对三者的mRNA和蛋白水平都有不同程度的上调作用。结论：己烯雌酚促黑素合成可能与上调酪氨酸酶表达、增加其活性有关。第三部分cAMP-MITF通路参与己烯雌酚调节酪氨酸酶及黑素合成作用方法：不同浓度己烯雌酚干预后,用ELISA法检测细胞内cAMP的变化,RT-PCR和Western blot检测MITFmRNA和蛋白水平的变化。然后用特异性的PKA抑制剂H891μM干预黑素瘤细胞1h,再用不同浓度的己烯雌酚作用于黑素瘤细胞24h,测定其黑素合成量、酪氨酸酶活性及其mRNA的变化以及MITF的mRNA水平的变化。结果：己烯雌酚对细胞内cAMP浓度和MITF的mRNA和蛋白水平都有上调作用。而在PKA途经受到抑制的情况下,己烯雌酚促进黑素合成、上调酪氨酸酶活性及mRNA的作用均受到抑制,同时其对MITF的上调作用也受到抑制。结论：提示己烯雌酚对黑素合成的作用可能通过cAMP/MITF/TYR途径调控。综合以上实验结果,己烯雌酚对黑素瘤细胞黑素合成有一定程度促进作用,而这一作用可能通过cAMP/MITF/TYR途径发挥作用。本实验结果为乙烯雌酚临床应用于治疗色素脱失性疾病提供了理论基础和实验依据。