背景脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)的治疗一直是困扰医务工作者和社会学者的难题之一,中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤后的再生修复一直是神经科学研究的热点和难点。目前多数学者认为,损伤后中枢神经元自身缺乏足够的再生能力和局部环境中的再生抑制性因子是引起轴突再生失败的主要原因,其中髓磷脂和瘢痕相关抑制分子可能起着主要作用。目前已确认的中枢神经髓鞘来源的主要抑制因子有以下三种:Nogo-A、髓磷脂相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein, MAG)和少突胶质细胞糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein, OMgp),三者在CNS中分别由少突胶质细胞和一些神经元产生,存在于髓鞘的内外环和少突胶质细胞的表面,它们具有诱导生长锥塌陷和抑制轴突生长的功能。研究表明Nogo受体(Nogo receptor, NgR)是Nogo-A、MAG和OMgp的共同受体,介导三者的轴突再生抑制作用,NgR在CNS的多个不同类型的神经元中表达,其作为配基和信号传递与调节的功能域已经明确,NgR mRNA在CNS中多种类型的神经元中广泛分布,包括大脑皮质神经元、海马神经元、小脑蒲肯野氏细胞和脑桥神经元等,NgR的分布与其mRNA的分布基本一致。另外,研究者们发现,在中枢白质不存在NgR mRNA,而后者的少突胶质细胞却表达Nogo-A,从而认为:存在于中枢白质的Nogo-A与分布于中枢灰质的NgR正是通过特异性的配体受体式结合,使得原先对Nogo-A并不敏感的中枢神经元具有对Nogo-A较为敏感的反应性,从而表现出Nogo-A对中枢神经的抑制活性。目前认为脊髓损伤后可以再生的条件包括:损伤神经元仍具备表达有关生长基因的能力、提供神经营养子、提供轴突生长必需的基质分子和减少轴突生长的不利因素(轴突生长相关抑制因子及瘢痕组织形成等),因此脊髓损伤后可能的治疗方案有:胎儿神经组织移植、外周神经组织(细胞)移植、基因治疗等。虽然胎儿神经组织排异性低、分裂能力强、分化程度低,用于SCI后神经功能恢复效果较好,但由于来源和道德伦理上的问题限制了它的临床应用;CNS系统的免疫应答能力微弱,但对抗原性较强和种属相差甚远的靶细胞仍具有较强的免疫排斥性,外周神经组织移植时远期疗效甚微;基因治疗的手段较外周神经组织移植排异性小,且一次治疗可能起到长期的效果。因此,大多数学者认为脊髓损伤的基因治疗是最有前途的治疗方法之一,也是当前治疗SCI研究的热点。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应序列基因表达的过程,它能特异地沉默内源或外源性靶基因的表达。RNAi技术目前已应用于多学科的研究,可应用于多种生物体内,包括植物、真菌、病毒、哺乳类动物等。RNAi技术的最新发展是体外合成siRNA的应用,在哺乳动物细胞内,其既可特异性抑制、降解同源的RNA序列,有效阻止相应蛋白质的表达,又可避免导入过长的双链RNA (double strand RNA, dsRNA)引起的非特异性基因降解和细胞死亡,为以基于RNA的药物治疗人类疾病奠定了基础。我们在前期实验中成功地应用化学合成的NgR特异性小干扰RNA(siRNA)下调原代神经元NgR的表达水平,并筛选出两个基因沉默效率较高的小干扰RNA序列siNgR199、siNgR964,它们的基因沉默效率分别为93.5%和92.14%。但化学合成小干扰RNA效应是暂时的,应用时易受环境因素的影响。如果将NgR特异性小干扰RNA序列设计成小发卡式RNA结构,再将其克隆入质粒或病毒载体,转染后能够直接在神经元内长期、稳定表达小干扰RNA。在活体内介导RNAi沉默中枢神经系统基因表达时,目前趋向于应用慢病毒(lentiviral, LV)及腺病毒伴随病毒(adeno-associated viral,AAV)载体,这些病毒载体能感染非分裂细胞并具嗜神经性,主要用来感染神经细胞。同AAV比较,慢病毒载体在感染非分裂性的神经元细胞时特别适合,同时对干细胞和其他体外培养的细胞具有高度亲嗜性,这种特性在其他的病毒载体中并不存在。慢病毒载体具有携带9kb基因信物的容量,对神经元具有高亲嗜性,不具有逆向转运的能力,对干细胞也具亲嗜性,因此在CNS系统中作为介导RNAi的载体非常理想。本研究首先构建慢病毒NgR特异性小干扰RNA重组体,优化NgR特异性小干扰RNA的合成、递呈,在选择NgR同源的小RNA系列时,我们选择基因沉默效率较高的siNgR199;然后体外培养大鼠皮层神经元细胞,应用慢病毒重组体进行大鼠原代皮层神经元细胞NgR特异性RNA干扰,验证其有效性;最后在大鼠SCI模型上证实慢病毒介导的NgR特异性siRNA能够成功长期下调NgR蛋白表达、诱导神经纤维再生和一定程度上促进脊髓损伤后大鼠神经功能恢复。目的:1.设计、构建携带siNgR199慢病毒重组体。2.在细胞水平探讨慢病毒重组体沉默NgR基因的效应及最佳给药剂量。3.在动物模型水平探讨慢病毒重组体沉默NgR基因对大鼠SCI后神经轴突再生和神经功能的影响,为进一步应用临床试验提供理论依据。方法:1.按照E1bashir等设计原则和siRNA表达载体的要求,设计构建NgR特异siNgR199慢病毒重组体,并进行酶切鉴定及基因测序;2.体外培养大鼠原代皮层神经元细胞,1周后进行不同滴度的重组慢病毒转染,通过荧光镜观察重组体转染情况,确定最适转染的慢病毒重组体MOI值,并应用实时荧光定量PCR检测内源性NgR基因沉默效果;3.采用改良Allen’s打击法建立大鼠中度脊髓损伤模型;4.36只成年雌性SD大鼠随机分为生理盐水组、空慢病毒组、重组慢病毒组(各12只),脊髓损伤后1周行皮层体感运动区多点注射给药,给药8d后应用实时荧光定量PCR检测注谢区皮层神经元细胞NgR mRNA表达情况,免疫组化观察NgR蛋白表达状况。5.36只成年雌性SD大鼠随机分为生盐水组、空慢病毒组、重组慢病毒组(各12只),脊髓损伤后1周行皮层体感运动区多点注射,在脊髓损伤后每周,对大鼠的神经功能进行行为学评分;给药后6周行皮层体感运动区注射神经示踪剂,给药后8周通过组织学观察脊髓损伤神经修复情况。结果:1.构建的NgR特异性siNgR199慢病毒重组体经酶切鉴定、基因测序仪测序,结果与设计序列完全相符,目的基因序列准确无误,慢病毒重组体构建成功。2.慢病毒重组体实现大鼠原代皮层神经元转染,96h后神经细胞开始表达绿色荧光,146h后绿色荧光最强,适合高效感染的MOI值为3;转染192h后收集细胞进行实时荧光定量PCR检测,结果显示目的基因抑制效率为61%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。3.在改良Allen’s大鼠脊髓损伤模型中行皮层体感运动区分点注射给药,给药8d后取注射区脑组织进行实时荧光定量PCR检查NgR表达水平,结果显示,重组慢病毒注射组与生理盐水注射组及空慢病毒注射组比较有统计学意义(P<0.01);注射区脑组织切片进行免疫组化检查NgR蛋白表达情况,生理盐水组及空慢病毒组可见清晰阳性细胞,重组慢病毒组NgR染色阳性颗粒减少,从而说明在活体内大脑皮层注射慢病毒重组体转染后实现了NgR基因的沉默。4.大鼠脊髓损伤后每周行BBB评分,所有实验大鼠在损伤后第1天都表现为丧失所有后肢运动,BBB评分均为0分,但损伤后1周内未给药情况下可自然恢复至BBB评分平均为8分水平,损伤后3周内恢复的幅度较大,损伤3周后(给药2周后)恢复减慢,但损伤5周后(给药4周后)重组慢病毒组恢复情况明显好于空慢病毒组及生理盐水组;虽然各实验组SCI大鼠的神经功能均有一定程度的神经恢复,但重组慢病毒组和生理盐水组及空慢病毒组之间神经功能评分结果差异显著(P<0.01),生理盐水组和空慢病毒组之间神经功能评分结果无明显差异(P >0.05)。组织学和神经纤维染色检查结果:重组慢病毒组损伤部位形成的空洞比较少,可观察到神经纤维通过、有更多髓鞘组织形成及胶质细胞增生;神经示踪观察重组慢病毒组有少量的轴突生长通过损伤区域。结论:本研究成功构建了NgR特异性siNgR199慢病毒重组体,重组体能够在大鼠体外培养的原代皮层神经元和体内脊髓损伤模型中实现RNA干扰,较长时间下调神经元的内源性NgRmRNA表达,并在一定程度上促进脊髓神经轴突再生和大鼠后肢运动功能的恢复。我们认为慢病毒载体介导的RNA干扰可能成为脊髓损伤治疗的有效手段之一,其可能的作用机制为:慢病毒重组体能稳定地在皮层神经元中表达RNA干扰,长期诱导NgR基因沉默,从而减少髓磷脂相关抑制因子Nogo、MAG和Omgp与NgR结合,最终能够促进脊髓损伤区神经轴突的再生。