背景神经内分泌肿瘤是一大类疾病的总称,指起源于全身任何部位神经内分泌细胞的良恶性肿瘤。神经内分泌细胞遍布全身各处,因此神经内分泌肿瘤可以发生在体内任何部位,但最常见的是胃、肠、胰腺等消化系统神经内分泌肿瘤,约占所有神经内分泌肿瘤的2/3左右。在之前,结肠的神经内分泌肿瘤发病率较低,所以一直没有引起关注。但近年来的内分泌肿瘤从25年前的0.004%逐年上涨,如今上涨了10倍。研究显示来源消化系统的神经内分泌肿瘤约占整体神经内分泌肿瘤的55%~70%。与其他神经内分泌肿瘤不同,神经内分泌肿瘤具有特殊的生物活性物质如血清素,组胺,嗜铬素等。由于不断上升的患病率和临床的特殊表现,该病正引起关注。有研究根据美国多中心共35825个病例进行分析发现本疾病发病年龄中位数为65岁。日本研究结果显示2005年的神经内分泌肿瘤发病率约为2.1/104。结直肠神经内分泌肿瘤的最常见发病部位主要位于直肠(51.08%),第二位于升结肠处(包括盲肠33.04%)第三位于乙状结肠(5.94%),其余部位还有直乙交界处(4.54%)、横结肠(1.88%)和降结肠(1.10%),另有约2.42%不能明确具体部位。目前我国尚未建立覆盖全国的肿瘤登记系统,无法对神经内分泌肿瘤的流行病学数据进行权威分析。手术对神经内分泌肿瘤进行切除是一种能够达到治愈的常用的治疗手段。而对肿瘤直径>2 cm并且有侵犯肌层、有淋巴结转移的患者来说,术后易出现肿瘤的局部复发,术后加以放疗可降低局部复发的风险。近年来,随着肿瘤靶向治疗的发展,靶向药物的出现给NET的治疗带来了新的突破。mTOR可对细胞外包括生长因子、胰岛素、营养素、氨基酸、葡萄糖等多种刺激产生应答。它主要通过PI3K/Akt/mTOR途径来实现对细胞生长、细胞周期等多种生理功能的调控作用。近年来,国内外学者对mTOR信号传导通路的重要作用给予了广泛的重视,相关报道屡见不鲜,尤其对该通路在肿瘤方面的研究日渐深入,一些研究得出的结论对临床治疗发挥着积极的指导作用。上面已经叙述了PI3K/Akt/mTOR信号通路在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用,该通路中的Akt因子可调控多个与细胞凋亡有关的家族从而抑制细胞凋亡、促进细胞生存。另一上游因子PI3K可通过Akt、mTOR将有丝分裂信号传递给下游因子核糖体S6蛋白激酶(p70S6K),使细胞周期的主要相关蛋白如细胞周期素、细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)的翻译上调,同时通过CDK4抑制p2laPl等的表达,促进Gl期进展,使细胞周期加速,促进细胞增殖和分化,从而促进肿瘤的发生与发展。活化的P13K/Akt通路可通过多种途径上调HIF-1d,促进血管内皮生长因子(VEGF)的表达,促使血管新生,为肿瘤细胞增加血供。p70S6K作为mTOR的下游蛋白之一,活化后可促进细胞运动;活化的Akt还可增加NF-κB(核转录因子-κB)的转录活性,增加肿瘤细胞的运动功能,有助于癌细胞侵袭;同时P13K/Akt/mTOR途径还可上调基质金属蛋白酶-2(MMP-2)mRNA和蛋白质表达,促进肿瘤细胞的转移。由此可知,活化的P13K/Akt/mTOR信号传导通路可以抑制细胞凋亡,加快细胞周期进展,进而促进细胞生长和增殖,同时参与血管新生,并参与肿瘤的侵袭和转移,在肿瘤的形成和发展中扮演非常重要的角色。依维莫司是西罗莫司的衍生物,又称40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素,或40-O-(2-羟乙基)-西罗莫司,属于干扰细胞通讯防止肿瘤细胞生长的激酶类药物,是一种口服哺乳动物雷帕霉素(mTOR)抑制剂,以往临床上主要用来预防肾移植和心脏移植手术后的排斥反应。目前也可用于治疗已使用过两种抑制血管内皮生长因子受体激酶抑制剂舒尼替尼(Sutent,辉瑞制药)和索拉非尼(Nexavar,拜耳制药)的晚期肾癌患者,而且毒副作用较轻微。舒尼替尼和索拉非尼是多种激酶抑制剂(作用于多种细胞靶位),而依维莫司则阻断哺乳动物雷帕霉素标靶(mTOR)的专一蛋白质,干扰癌症细胞的生长、分化和代谢。依维莫司与细胞内蛋白质FKBP-12结合,形成抑制络合物,从而抑制mTOR激酶活性,同时降低mTOR的下游效应物S6核糖体蛋白激酶(S6K1)和真核延伸因子4E结合蛋白(4E-BP)的活性。此外依维莫司抑制低氧诱导因子(如HIF-1)的表达和降低血管内皮生长因子(VEGF)的表达,体内外研究均显示可降低细胞增生、血管生成和葡萄糖摄取。目的本课题拟选取神经内分泌肿瘤临床组织标本和细胞系检测检测mTOR通路相关蛋白、Ki-67和Caspase-3的表达,然后进行依维莫司干预,观察其治疗效果,最后探讨依维莫司在治疗神经内分泌肿瘤中涉及的自噬分子机制,并为神经内分泌肿瘤的治疗提供新方向。方法2011年8月至2015年8月的244名在云南省第一人民医院住院的神经分泌性肿瘤患者纳入本研究。244例患者随机在手术前分为对照组(无依维莫司治疗)和依维莫司组。所有患者通过临床病理和在以前的研究中描述排除非神经内分泌肿瘤诊断患者,并且所有患者具有完整的临床数据。男性112例,女性132例,年龄20?80岁,平均年龄47.5岁。根据由世界卫生组织在2014年发布NETs六级标准,有28个一级36例,二级64例,三级64例,四级40例,五级40例,和36例六级。实验方案已经由云南省第一人民医院的伦理委员会预先批准和从所有人获得患者和健康志愿者签署的书面同意书。通过免疫组化、RT-PCR及westernblot检测其Ki67及caspase-3的表达变化。并且在细胞水平通过MTT及western blot进行依维莫司对神经内分泌肿瘤细胞株BON的细胞增殖;mTOR信号通路及自噬的相关机制进行探讨。结果1.Ki67阳性为细胞核紫色或紫褐色部位,由此可以发现,在神经内分泌肿瘤组织中,Ki67表达显著升高。同时对肿瘤组织做了mRNA水平及蛋白水平的检测,也获得了一致的结果,在肿瘤组织中Ki67呈高表达。2.在Ki67表达与肿瘤分级相关性分析可以发现,分级较低者Ki67表达更高。3.caspase-3阳性为细胞核红色或紫色部位,由此可以发现,在神经内分泌肿瘤组织中,caspase-3表达显著降低。同时对肿瘤组织做了mRNA水平及蛋白水平的检测,也获得了一致的结果,在肿瘤组织中caspase-3呈低表达。4.在caspase-3表达与肿瘤分级相关性分析可以发现,分级较高者caspase-3表达更高,由此推断在肿瘤组织中凋亡降低。5.在没有经过依维莫司治疗的肿瘤组织中,Ki67的mRNA及蛋白水平较癌旁组织有显著的升高,而在对患者进行依维莫司治疗干预后,肿瘤组织的Ki67的mRNA及蛋白水平与癌旁组织比较变化不大,没有统计学差异。6.对caspase-3进行检测中,发现未经过依维莫司治疗的肿瘤组织中,caspase-3的mRNA及蛋白水平较癌旁组织有明显的降低,而在对患者进行依维莫司治疗干预后,肿瘤组织的caspase-3的mRNA及蛋白水平与癌旁组织比较变化不大,没有统计学差异。由此证实依维莫司能够促进肿瘤细胞的凋亡。7.BON细胞加了依维莫司10nM干预后,与没加干预的组别比较,24h后的细胞增殖情况显著被抑制,两者有显著的统计学差异。8.依维莫司10nM干预后mTOR信号通路的相关因子mTOR、p70S6K与4EBP1的磷酸化水平受到了抑制,mTOR信号通路被抑制。结果与依维莫司是mTOR信号通路抑制剂相一致。9.给予依维莫司10nM干预后,自噬相关分子LC3Ⅱ及beclin的蛋白表达水平有了显著的升高,两者比较有明显的统计学差异。结论1.依维莫司无论是在人体水平还是在细胞水平对神经内分泌肿瘤都有明显的抑制作用。2.可能与其抑制mTOR信号通路后,诱导肿瘤细胞的自噬、促进细胞凋亡及抑制了细胞增殖。3.mTOR信号通路能够作为治疗神经内分泌肿瘤的一个新靶点,为神经内分泌肿瘤的治疗提供新的思路与理论依据。