缢蛏对氨氮胁迫的生理、免疫以及细胞凋亡的响应

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缢蛏(Sinonovacula constricta)是软体动物双壳纲贝类,生活在西太平洋沿岸的低至中潮间带,是我国四大海水养殖贝类之一,具有重要的经济价值。氨氮是水产养殖中最主要的有毒环境因子之一,对缢蛏的养殖及对其在生态养殖中所产生的功能影响颇深。本研究评估了缢蛏在不同生长阶段的氨氮耐受能力;从生物积累、呼吸代谢、组织损伤、解毒策略四个角度研究了缢蛏在氨氮胁迫下生化水平的应激变化;研究了缢蛏抗氧化系统在氨氮胁迫下的动态变化,探究了活性氧与抗氧化酶在时间、空间上的平衡关系;检测了缢蛏鳃和肝胰腺的细胞凋亡情况,初步验证了线粒体细胞凋亡途径在缢蛏体内的激活。本研究在解析氨氮对海洋贝类抗氧化系统和细胞凋亡的作用机制以及健康养殖提供了一定的理论参考。1、缢蛏在急性氨氮胁迫下的耐受能力采用生物毒性实验方法研究了氨氮对小规格(壳长1.5±0.27 cm)、中规格(壳长3.5±0.41 cm)和大规格(壳长5.7±0.79 cm)缢蛏的毒性作用。结果表明:缢蛏在氨氮中毒后无闭壳行为。三种规格缢蛏在行为上表现为闭壳肌张力减小、行动迟缓。中规格以上个体在胁迫后出现水管、斧足萎缩失活,鳃先溶血肿胀后萎缩的现象。(1)非离子氨对小规格缢蛏的72 h,96 h半致死浓度为3.689 mg/L,2.501mg/L,安全浓度为0.2501 mg/L。(2)非离子氨对中规格缢蛏的72 h,96 h半致死浓度为4.217 mg/L,2.837mg/L,安全浓度为0.2837 mg/L。(3)非离子氨对大规格缢蛏的72 h,96 h半致死浓度为10.860 mg/L,5.586mg/L,安全浓度为0.5586 mg/L。2、氨氮胁迫对缢蛏生理生化的影响将中规格缢蛏暴露于不同浓度(0.25 mg/L、1.25 mg/L、2.5 mg/L)非离子氨中72 h,并在无氨海水中继续恢复72 h,进而分析氨氮对缢蛏呼吸代谢水平、组织损伤和解毒情况的影响。结果表明:(1)三种非离子氨浓度下的缢蛏血氨浓度皆随时间延长而显著上升,并在72h到达峰值,各组之间均表现为差异显著(P<0.05),最高组可达初始值的247倍。恢复72 h后,各组均不能恢复到正常水平。(2)胁迫72 h后,高浓度组的乳酸(LD)含量到达峰值并显著高于中低浓度组(P<0.05)。在恢复72 h后,三个浓度组均有明显的下降趋势,高浓度组的LD水平始终显著高于初始值(P<0.05)。在高浓度组中,乳酸脱氢酶(LDH)从氨氮暴露的24 h开始,始终显著高于中低浓度组(P<0.05)。恢复72h后仅有低浓度组恢复到了正常水平。(3)当暴露时间达72 h后,高浓度组鳃组织及血液中的谷草转氨(AST)酶活性都显著高于中低浓度组(P<0.05)。高浓度组鳃组织中的AST活性在恢复的72 h中无下降趋势。(4)缢蛏肝胰腺组织中的谷氨酰胺(Gln)含量从胁迫72 h开始,中高浓度组的Gln含量显著高于初始值及低浓度组(P<0.05)。高浓度组的谷氨酰胺合成酶(GS)活性在胁迫48 h后显著高于中低浓度组并在72 h达到峰值(P<0.05)。3、氨氮胁迫对缢蛏抗氧化系统的影响将中规格缢蛏暴露于0.25 mg/L、2.5 mg/L的非离子氨中72 h,并在无氨海水中恢复72 h。研究了氨氮对缢蛏鳃、肝胰腺内活性氧积累量和抗氧化酶活性及相关基因表达量的变化。结果表明:(1)在缢蛏鳃组织中,超氧阴离子(2-)水平在暴露后上升并在72 h到达峰值,在恢复阶段也出现了降低的趋势。过氧化氢(H2O2)含量的变化趋势和2-类似,在胁迫开始后的各时间段均显著高于初始水平(P<0.05)。各组超氧化物歧化酶(SOD)与谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的酶活性及基因表达量在氨氮胁迫下都有所上升。高浓度组CAT的酶活性及基因表达量均受到了抑制。(2)缢蛏肝胰腺中的2-和H2O2含量在胁迫开始后明显上调,且两种活性氧的峰值都出现在72 h。除低浓度组的H2O2含量外,缢蛏肝胰腺中的ROS含量在恢复72 h后仍显著高于0 h(初始值)(P<0.05)。高浓度组的SOD相关指标在24 h内下降,并在72 h前转为上升趋势。高浓度组的CAT酶活性在胁迫阶段受到抑制。4、氨氮胁迫对缢蛏细胞凋亡的影响将中规格缢蛏暴露于0.25 mg/L、2.5 mg/L的非离子氨中72 h,并在无氨海水中恢复72 h,分析了氨氮对线粒体凋亡通路相关基因表达量的影响,采用TUNEL法原位检测了肝胰腺、鳃组织的细胞凋亡情况。结果表明:氨氮胁迫显著影响了BAX、Bcl-2、Cyt-c、Caspase-7基因的表达量,激活了线粒体凋亡通路。Bcl-2表达量在低浓度组和高浓度组之间有不同的趋势。高浓度组中Bcl-2的相对表达量在72 h达到峰值,并在72 h的恢复后明显下降(P<0.05)。细胞凋亡图显示,细胞凋亡程度与胁迫时间和胁迫浓度正相关,同时缢蛏鳃组织的细胞凋亡程度高于肝胰腺组织。
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