褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronate,M)及其C5差向异构体α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronate,G)通过;β-1,4糖苷键链接而成的线性分子。褐藻胶寡糖具有重要生物活性,如抗肿瘤、抗凝血、免疫保护。寡糖片段的生物活性与聚合度大小、M/G比例等密切相关。因此,如何高效制备具有特定分子特征的褐藻胶寡糖逐渐成为海洋生物资源高值化领域的研究热点。褐藻胶裂解酶通过β-片消去机制催化褐藻胶的降解,产生非还原性末端含有不饱和糖单元(△)的寡糖产物。与物理或化学方法相比,褐藻胶的酶法降解具有反应条件温和、产物结构明确、环境污染小等优点,且酶法制备的不饱和寡糖具有较强的生物活性。内切型褐藻胶裂解酶在降解多糖时,最终产生一系列大小的不饱和寡糖产物;外切酶则主要产生单一寡糖产物,如不饱和单糖△。相比之下,褐藻胶内切酶在寡糖的制备与应用中具有更重要的价值。迄今已报道了 100多个不同的褐藻胶裂解酶。相关研究集中在产酶菌株、酶与基因资源的发掘,以及酶的生化特征与高级结构等研究。相对而言,系统地阐释酶的寡糖生成特征(不同聚合度不饱和寡糖产物之间的摩尔比、系列不饱和寡糖产物的结构特征及其规律性)及对应的底物选择性、底物降解特性(最小底物、最小产物及其生成方式)等寡糖生成机制的研究相对较少,缺少关于分子改造对酶的寡糖生成特征影响的深入研究,无法为酶的精确应用及其分子改进提供相应的理论背景与技术借鉴。近期,课题组报道了Flammeovirga sp.MY04菌株来源的一个G-专一性的褐藻胶内切酶rA1y5,阐述了底物降解模式和寡糖生成特性等酶学特征,为高分子量富M段系列不饱和寡糖的制备提供了一个有效工具及其技术体系,相应的分子截短研究获得了一个增产较大寡糖产物的有效技术途径。在此基础上,为进一步全面了解各类褐藻胶裂解酶在寡糖制备中的应用价值与特色,本文选取兼性和M-专一性两类内切酶进行了深入分析,为褐藻胶内切酶在医疗、生物质能转化和寡糖制备中的精确应用提供一定的理论和系统的技术支撑。研究内容及结果如下:1.对海洋来源的多糖降解菌Flaaammeovirgasp.MY04的基因组进行分析,发现候选褐藻胶裂解酶Alyl的N端含一个碳水化合物结合域、C端含一个假定的催化结构域Alg2。BLASTp在线分析表明,Aly1与已鉴定的褐藻胶裂解酶最大相似性为30%,是PL7超家族成员。本文对全长蛋白质Aly1及仅含催化结构域的截短体蛋白质Aly1-T185N分别进行了重组表达与纯化。生化特征研究表明:rAly1最适反应条件是50℃和pH6.0,具有广泛的温度稳定性和pH稳定性,Na+、K+、Li+、C02+、Fe2+、Mg2+、Ni2+、甘油、β-巯基乙醇及DTT等化学试剂对酶具有促进作用,0-1 M NaCl对酶具有轻微的抑制作用;初步的底物偏好性分析、深入的寡糖产物纯化与结构鉴定等研究证实:rAly1是兼性内切型褐藻胶裂解酶且具有G倾向性,最小寡糖底物是饱和的四糖G4,M4和不饱和四糖UDP4,最小寡糖产物包括饱和的单糖G,M和不饱和的二糖UDP2。关于rAly1的主要新颖点包括:(1)阐明了具G倾向性的兼性褐藻胶内切酶的寡糖生成特性。即:rAly1彻底降解褐藻胶时主要生成以不饱和的二糖和三糖为主的终产物,其中不饱和二糖是AG单元,不饱和三糖的非还原端兼有△G和AM两种类型,更大产物如不饱和四糖的非还原端主要是AM类型。rAly1-T185N的寡糖生成特征与之相似。这一结构特征及其演替规律与MY04来源的G-专一性褐藻胶内切酶rAly5的寡糖生成特性相似。(2)系统分析了褐藻胶内切酶可变的底物降解模式,并阐明了糖链末端类型、聚合度大小和M/G比例等底物的关键分子特征对酶的底物降解模式的影响及其规律。包括:1)底物末端结构的影响:寡糖底物的饱和型非还原端是导致酶产生饱和单糖M、G或系列较小饱和寡糖产物的关键因素,相对应的,不饱和单元△则是酶产生≥UDP2的不饱和寡糖产物所必需的,而还原端的2-AB标记能显著抑制酶的活性,且使可降解底物聚合度更大,并抑制酶的单糖生成能力。2)聚合度大小的影响:酶可从较小的单一或多个不同大小的糖链产生一系列较小的不饱和寡糖产物,且从非还原端产生的饱和寡糖主产物的大小随底物聚合度的增加而相应增大。3)M/G比例的影响:降解同一聚合度的聚M或G寡糖时,所生成的不饱和寡糖产物大小一致但是其摩尔比存在着显著差异,这可能与酶是兼性且具有G倾向性有关。(3)rAly1-T185N与rAly1具有相似的生化特征和酶学特性。显著不同的是,非催化区NCR的截短提高了酶对较小的饱和型聚M段寡糖底物如M4和不饱和寡糖片段如UDP4的降解率,而对饱和型聚G段系列寡糖底物的大小范围和降解率没有改变,从而增强了截短体的M倾向性及酶活。2.铜绿假单胞菌和棕色固氮菌的褐藻胶生物合成操纵子内,都含有一个排布位置相似的褐藻胶裂解酶基因aalgL,其产物是典型的M-专一性褐藻胶裂解酶。已有研究充分揭示了 AlgL参与褐藻胶生物合成过程中的功能,即随机剪切褐藻胶分子以调节向外分泌的多糖的聚合度。但是,关于酶的底物降解模式、寡糖产物的生成特性等,未见详细报道,无法为酶的商品化应用提供详细的背景信息和技术参数。铜绿假单胞菌的褐藻胶裂解酶Pae-AlgL和棕色固氮菌的Avi-AlgL分子中仅含有一个褐藻胶裂解酶结构域,归类于PL5家族。这两种酶的蛋白质序列相似性为66%,重组酶的生化特征与基本酶学性质等与已有报道相一致,但彼此略有区别。关于Pae-rAlgL和Avi-rAlgL的主要新颖点如下:(1)将基因按照大肠杆菌的密码子偏好性分别进行了密码子优化与人工全合成,结果在未改变氨基酸序列的基础上,异源表达显著提高了水溶性蛋白的产量。生化特征分析则表明两个重组酶的活性不依赖于NaCl,但0-1 M浓度下的NaCl对酶活具有促进作用。(2)阐明了 M-专一性褐藻胶裂解酶的寡糖终产物结构特征。即这两种酶降解褐藻胶的最终主产物是系列不饱和寡糖片段,包括UDP2到UDP7。对于Pae-rAlgL,其中UDP2鉴定为AM单元,UDP3和UDP4的非还原端兼有AM和AG两种类型,UDP5到UDP7主要是AG末端。Avi-rAlgL与之相似,但只有UDP3的非还原端兼有△M和AG两种类型,而UDP4到UDP7主要是AG末端。整体上,随着聚合度增大,寡糖产物的非还原端含AM的比例逐渐降低而含AG的比例逐渐增加至完全是AG型。这与G-专一性褐藻胶内切酶rAly5的系列寡糖终产物的末端结构特征相反,但规律相似。两种酶的较大不饱和寡糖产物均不能被深度酶切,因而可被视为富G型不饱和寡糖片段。(3)发现M-专一性褐藻胶内切酶在降解较小的饱和寡糖底物时,与具有G倾向性的兼性内切酶rAly1相似,也具有可变的底物降解模式,且底物末端结构、聚合度大小、M/G比例等是引起酶的底物降解模式发生变化的重要因素。综上,本文所得具G倾向性的兼性褐藻胶内切酶rAly1及其分子截短体均能高效彻底降解褐藻胶,主要产生较小聚合度的不饱和二糖和不饱和三糖,有利于进一步进行生物质能转化。两个M-专一性的褐藻胶裂解酶能用于彻底降解褐藻胶,专一生产较大的富G型不饱和寡糖片段。在此基础上,本文发现并阐述了两类内切型褐藻胶裂解酶可变的底物降解模式、模式的变化规律及重要的影响因素。