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凉州熏醋因其独特的风味而闻名,如何提高传统发酵食醋的风味,近年来引起了极大的研究兴趣。四甲基吡嗪(TTMP)是一种从不同的传统发酵食品中发现的风味物质,而乙偶姻(ACT)是其合成的生物前体。本文以凉州熏醋传统酿造工艺为依托,采用经典的微生物筛选方法从其醋醅中初筛产酸功能微生物,通过Voges-Proskauer(V-P)显色反应法和GC-FID复筛获得高产ACT的菌株并进行分子生物学鉴定,同时使用响应面法对产ACT的发酵条件进行了优化。采用GC-FID和理化指标测定方法,通过动态跟踪菌株发酵特性与积累ACT和TTMP的关系,采用GC-MS动态跟踪发酵过程挥发性成分变化情况,结合数理统计和理性分析,初步明确了高产四甲基吡嗪菌株的代谢途径和机理,并得到其风味物质产物谱,旨在为提高食醋品质提供菌株来源。主要研究成果如下:1.以凉州熏醋酿造过程中醋酸发酵阶段的醋醅为原料,分离得到了10株芽孢杆菌(Bacillus),10株乳酸菌(LAB),20株酵母菌(yeast)和200株醋酸菌(AAB)。以上述菌株作为出发菌株,采用V-P显色反应初筛得到51株产ACT菌株,包括:8株芽孢杆菌,9株乳酸菌,6株酵母菌和28株醋酸菌。以GC-FID法复筛获得一株产ACT达到14.02g/L、四甲基吡嗪产量达到2.77g/L的醋酸菌C92,通过生理生化及16S r RNA序列对比鉴定该高产菌株为巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)。2.对高产菌株A.pasteurianus C92产ACT的发酵条件进行了优化。单因素得到该菌株在pH 7.0,温度32℃,接种量7%,转速180r/min下产ACT量较高,在此基础上使用Design-expert 8.0设计响应面优化实验,得到最佳发酵条件为培养温度31.31℃,接种量8.27%,pH 6.55,摇床转速为209r/min,乙偶姻产量最大,达到19.04 g/L,比原始发酵产量高35.8%,四甲基吡嗪产量达到3.82g/L,比原始产量高37.9%。3.动态跟踪A.pasteurianus C92的发酵特性及过程,发现该菌株的积累ACT的过程是属于生长关联发酵类型(growth-associated fermentation),ACT为菌株的糖代谢初级产物;通过GC-MS分析菌株在7天时间内的代谢产生的挥发性成分动态关系,并以数理分析初步推断了发酵机理为以己糖为出发能源,将己糖转化为ACT,到达一定浓度后,ACT开始合成另外一个重要的中间代谢产物异硫氰酸酯(C5H9NS),最后两分子C5H9NS环化并脱羧脱硫成一分子TTMP。4.GC-MS检测了该菌株的产物谱,得到了该菌株在发酵第六天所产风味物质最丰富,达到68种,其中吡嗪类达到13种,占总挥发性成分的9.71%,此外还有挥发性的酸类10种、酮类4种、酯类11种、醛类6种、醇类14种、酚类5种,其他5种,分别占总组分的12.99%、0.74%、4.46%、0.71%、28.21%、2.21%和1.75%。综合上述研究结果可知,凉州熏醋传统酿造过程是以醋酸菌为典型优势种群,其他微生物共同存在的一个多菌混合体系,在该过程中醋酸菌发挥着主要的作用。食醋酿造体系中的醋酸菌种是形成食醋主体共有成分的基础和关键,而通过GC-MS测定证明,Acetobacter pasteurianus C92发酵产生多种风味化合物,对凉州熏醋特征香气成分的产生存在影响,表明酿造过程中功能性微生物对凉州熏醋独特风味体系的形成起到了不可或缺的作用。