目的:复发性流产（recurrentspontaneousabortion,RSA）是指与同一性伴侣连续发生2次或2次以上在妊娠28周之前的胎儿丢失。随着女性生育年龄的推迟,“全面二孩”政策及“三胎”政策的出台,RSA发病率逐年升高,是全国乃至全世界范围内重要的健康难题。RSA病因复杂多样且临床表现缺乏特异性,对RSA进行诊治时,为明确病因往往需要进行系统性筛查,目前RSA已知的病因主要包括遗传因素、解剖因素、内分泌因素、凝血因素、免疫因素、感染因素及心理因素等,其中免疫因素是目前生殖免疫领域研究的热点及难点问题。相对母体而言,胚胎可被视为半同种异体移植物,一次成功的妊娠需要母体免疫系统对携带父系抗原的胚胎形成免疫耐受,如果免疫失衡将会导致不良妊娠结局的发生。近年来,研究表明约半数以上RSA与母体免疫功能紊乱相关,部分研究认为其与自然杀伤（Natural killer,NK）细胞数量及活性异常密切相关。自然杀伤细胞作为生物体固有免疫的重要组成部分,其功能也被逐渐认识,其不仅能参与细胞免疫,也可通过体液免疫参与RSA的发生和发展,故近年来NK细胞成为RSA免疫因素的研究重点。维生素D（Vitamin D,VD）是维持人体正常生理活动所必需的营养素,近年来研究发现其不仅能够发挥“经典”作用影响骨代谢,而且能通过维生素D受体（Vitamin D receptor,VDR）作用于靶基因,发挥包括调节细胞增殖、分化、凋亡及免疫调节等多种“非经典”生物学功能。维生素D受体在胎盘、蜕膜和卵巢中均存在表达,参与激素的合成和分泌并影响妊娠结局;VDR也在子宫内膜间质细胞中表达,调节胚胎着床过程。维生素D在妊娠期子宫蜕膜中的表达发生剧烈改变,维生素D代谢相关酶在妊娠早期的蜕膜中大量表达,且其活性形式,1,25-二羟维生素D3（1,25-dihydroxy-vitamin D3,1,25（OH）2D3）在胎盘局部浓度升高为孕前3-4倍,均提示维生素D在妊娠早期可能对母胎免疫交互中有发挥重要的生理作用。妊娠早期胎盘/蜕膜组织局部维生素D的升高与催化生成作用升高同时分解灭活作用降低有关,胎盘/蜕膜组织中参与维生素D催化的1α-羟化酶（CYP27B1）表达增加;参与维生素D分解的24-羟化酶（CYP24A1）表达降低。复发性流产患者维生素D低水平普遍存在,维生素D不足或缺乏的妇女流产率明显高于维生素D水平正常的妇女,提示维生素D低水平可能与RSA风险增加有关。有研究发现与正常妊娠的妇女相比较,RSA患者在蜕膜层面存在维生素D代谢通路异常,如VDR和CYP27B1表达降低等。越来越多的临床证据提示VD缺乏或不足与产科并发症的风险增加有关,如反复胚胎种植失败、自然流产、复发性流产、妊娠期糖尿病及妊娠期高血压疾病等。研究发现维生素D能够下调RSA患者外周血NK细胞的细胞毒性,提示维生素D对外周血NK细胞同样有免疫调节作用,维生素D可能作为妊娠期间母胎界面免疫功能的关键调节因子,参与妊娠免疫调节,但其具体调控机体免疫功能的机制尚不清楚。本课题组在前期研究中发现,与同期健康妊娠妇女对比,RSA流产患者外周血维生素D水平显著下降,因此,我们猜测1,25（OH）2D3能够通过调控NK细胞的数量与功能,从而在妊娠早期发挥重要作用。本研究拟分四个部分研究1,25（OH）2D3通过调控NK细胞参与复发性流产中的发病机制:第一部分,研究RSA患者妊娠早期血清25（OH）D3水平与外周血和蜕膜NK细胞亚群百分比的关系及蜕膜中VDR、CYP27B1和CYP24A1蛋白的表达水平。第二部分,研究补充维生素D3制剂后RSA患者外周血NK细胞亚群百分比及血清细胞因子的变化。第三部分,研究1,25（OH）2D3调控NK细胞功能与细胞因子分泌的作用及其机制。第四部分,研究维生素D缺乏的复发性流产小鼠模型的妊娠结局。方法:1.第一部分:选取2020年10月至2021年1月就诊于中国医科大学附属盛京医院计划生育门诊因胚胎停止发育行人工流产手术的RSA患者15例设为RSA流产组,因个人意愿终止妊娠的健康妊娠妇女17例设为对照组,正常妊娠的RSA患者26例设为RSA妊娠组。收集三组研究对象妊娠早期的空腹肘静脉血,采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测患者血清25羟基维生素D3水平,流式细胞术检测外周血NK细胞亚群百分比;收集RSA流产组与对照组人工流产手术时的早孕期蜕膜组织,通过密度梯度离心法提取蜕膜免疫细胞,流式细胞术检测蜕膜NK细胞亚群百分比;通过Western blot法检测蜕膜组织VDR、CYP27B1和CYP24A1蛋白的表达。2.第二部分:选取2020年6月至2021年4月初次就诊于中国医科大学附属盛京医院妇产科门诊,首诊当天测定血清25羟基维生素D缺乏（serum 25（OH）D3＜20ng/ml）的免疫型RSA患者134例作为研究对象,给予相同维生素D3制剂1725 IU/d,持续8周。分别在用药前后抽取研究对象空腹肘静脉血,采用电化学发光法检测患者血清25羟基维生素D水平,流式细胞术检测外周血NK细胞亚群百分比,利用免疫学分析与流式细胞仪分析相结合的方法检测血清细胞因子的变化。3.第三部分:选择稳定传代的人外周血NK-92（?）MI细胞进行实验。使用0、10、100nM的1,25（OH）2D3培养48小时后,通过实时荧光定量 RT-PCR（quantitative real time polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测VDR mRNA表达的变化,Western blot检测VDR蛋白的表达,确定最适处理浓度为 100nM。100nM 的 1,25（OH）2D3 及 NF-κB 抑制剂 BAY 11-7082 培养 NK 92（?） MI细胞48小时后,通过PCR检测IL-2、IFN-γ、TNF-α、穿孔素及颗粒酶B mRNA的表达,通过WB实验检测穿孔素、颗粒酶B和NF-κB蛋白的表达,通过ELISA检测IFN-γ和TNF-α的表达。第四部分,通过维生素D缺乏饮食构建维生素D缺乏的CBA/J小鼠模型,将小鼠分为维生素D正常组（Vitamin D normal,VDN）和维生素 D 缺乏组（VitaminD deficiency,VDD）,再以 CBA/J 雌鼠与 DBA/2 及 BALB/c雄鼠分别构建复发性流产模型及正常妊娠模型,ELISA法检测各组小鼠血清25（OH）D3水平,于孕第13.5天处死各组孕鼠,计算各组胚胎吸收率,探讨维生素D缺乏对复发性流产小鼠模型妊娠结局的影响。结果:第一部分:1.研究对象临床一般资料具有可比性。2.RSA流产组的血清25羟基维生素D3水平显著低于对照组及RSA妊娠组（P＜0.05）。3.外周血不同NK细胞亚群百分比的比较:RSA流产组总NK细胞百分比明显高于RSA妊娠组及对照组（P＜0.05）;RSA流产组CD56dimCD16+外周血NK细胞亚群百分比高于RSA妊娠组及对照组,P＜0.05;RSA流产患者CD56brightCD16-NK细胞百分比低于RSA妊娠组及正常早孕组,P＜0.05。4.蜕膜NK细胞亚群百分比的比较:RSA流产组CD56+蜕膜NK细胞百分比明显低于对照组,P＜0.05。5.与对照组相比,RSA流产组患者蜕膜VDR及CYP27B1蛋白表达水平降低,CYP24A1蛋白表达水平升高（P＜0.05）。第二部分:1.补充维生素D3制剂后RSA患者血清25羟基维生素D3水平明显升高（P＜0.05）。2.外周血CD56brightCD16-NK细胞亚群百分比升高,Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ水平下降（P＜0.05）。第三部分:0、10nM/ml、100nM/ml的1,25（OH）2D3培养基培养NK-92（?） MI细胞48h后,VDR mRNA及蛋白表达升高,且具有浓度依赖性。使用100nM的1,25（OH）2D3培养基与BAY 11-7082培养NK-92（?）MI细胞48h后,能够通过抑制NF-κB p65蛋白合成下调IFN-γ和TNF-α的表达水平;100nM的1,25（OH）2D3能够下调穿孔素、颗粒酶B蛋白的表达。第四部分:维生素D缺乏的复发性流产小鼠模型中,血清25（OH）D3水平显著降低,胚胎吸收率明显升高。孕前或孕后补充维生素D都能够在一定程度上提高血清25（OH）D3水平,降低胚胎吸收率,改善妊娠结局。结论:第一部分:RSA流产患者血清25羟基维生素D3水平显著低于正常妊娠妇女及RSA妊娠患者;外周血总NK细胞及CD56dimCD16+NK细胞亚群百分比升高,CD56brightCD16-NK细胞亚群百分比下降,蜕膜NK细胞百分比下降;蜕膜层面维生素D代谢障碍。提示维生素D低水平,外周血及蜕膜NK细胞亚群比例失调,蜕膜维生素D代谢紊乱是妊娠失败的危险因素。第二部分:外源性补充维生素D3促使RSA患者血清25（OH）D水平升高,外周血CD56brightCD16-NK细胞百分比升高,同时降低Th1型细胞因子IL-2及IFN-γ的产生,调控机体Th1/Th2型免疫偏移向Th2方向,促进免疫耐受的形成。第三部分:1,25（OH）2D3能够通过VDR信号通路,下调NK-92（?）MI细胞的穿孔素及颗粒酶表达,进而降低其细胞杀伤作用;通过抑制NF-K B p65蛋白合成降低促炎因子IFN-γ及TNF-α的表达。第四部分:维生素D缺乏增加复发性流产小鼠模型胚胎吸收率,是早期自然流产的危险因素之一,及时补充维生素D能够减少孕早期自然流产的发生。