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代谢重编程是肿瘤细胞的标志性特征之一,其代表性事件为Warburg效应,表现为即使在氧气充足的条件下,肿瘤细胞也要消耗大量葡萄糖进行糖酵解代谢,并产生大量的乳酸,为肿瘤细胞的快速增殖提供物质和能量保证。Warburg效应的发生受到多种代谢酶调节,其中丙酮酸激酶是催化糖酵解最后一步的限速酶,其M2型丙酮酸激酶(Pyruvate kinase M2,PKM2)在肿瘤细胞中特异性高表达,能够通过其酶活性及核内非代谢酶功能共同促进Warburg效应及肿瘤生长。PKM2功能可受乙酰化、磷酸化等多种蛋白质翻译后修饰调节。最近的研究报道,PKM2也可发生O-Glc NAc修饰。我们实验室前期工作表明,O-Glc NAc修饰能够促进PKM2解聚并入核,增强其核内非代谢酶功能,并通过质谱分析鉴定出T405和S406是PKM2的O-Glc NAc修饰位点,然而T405/S406双突变并不能完全消除PKM2 O-Glc NAc修饰,说明PKM2还存在其它的O-Glc NAc修饰位点,但是这两个位点突变后使PKM2 O-Glc NAc修饰水平明显降低。于是我们推测T405和S406可能是PKM2 O-Glc NAc修饰丰度最高的两个位点,但T405/S406的O-Glc NAc修饰能否调节上述PKM2功能尚不清楚。因此本文将就T405/S406的O-Glc NAc修饰对PKM2功能的影响进行研究。在本研究中,我们首先构建了糖基转移酶OGT的真核表达质粒,用于增强PKM2O-Glc NAc修饰水平。实验结果表明,在分别表达PKM2野生型(PKM2WT)和PKM2T405/S406双突变型(PKM2T405A/S406A)的MCF-7细胞中瞬时转染OGT质粒,可显著上调PKM2WT的O-Glc NAc修饰水平,然而对PKM2T405A/S406A的O-Glc NAc修饰水平没有显著影响。随后,通过戊二醛交联实验和免疫印迹法,我们发现这两个位点的O-Glc NAc修饰能够促进PKM2四聚体解聚。通过丙酮酸激酶活性检测试剂盒检测发现,T405/S406的O-Glc NAc修饰降低了PKM2酶活性。接下来,通过提取出细胞核蛋白和细胞浆蛋白并检测PKM2分布,结果表明T405/S406的O-Glc NAc修饰促进了PKM2核易位。利用免疫印迹法,我们发现T405/S406的O-Glc NAc修饰能够增强组蛋白H3 T11磷酸化和H3 K9乙酰化水平,进而促进MYC基因的表达,说明T405/S406的O-Glc NAc修饰能够增强PKM2非代谢酶功能。最后,通过葡萄糖含量检测试剂盒和乳酸含量检测试剂盒检测发现,T405/S406的O-Glc NAc修饰增加了细胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量,说明T405/S406的O-Glc NAc修饰促进Warburg效应。综上所述,本研究发现T405/S406的O-Glc NAc修饰能够促进PKM2四聚体解聚,增强核易位和非代谢酶功能,为进一步揭示O-Glc NAc修饰通过调节PKM2结构与功能调控Warburg效应的机制奠定了基础。