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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是老年期痴呆中最常见的病理类型,同时也是老龄人口中发病率最高的疾病之一。目前,使用乙酰胆碱酯酶抑制剂（Acet ylcholinesterase inhibitor,AChEI）或 N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂（N-methyl-D-asp artate receptor antagonist,NMDA Antagonist）的临床治疗尚属姑息治疗,只能适度地改善阿尔茨海默氏病患者的认知和行为,却无法减缓疾病的进展。因此,必须开发针对AD病理机制的疗法。已有研究显示,在认知障碍尚未出现的临床前阶段,就存在AD病理标志物β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）沉积。Aβ是由淀粉蛋白前β-分解酶 1（Beta-site APP-Cleaving Enzyme 1,BACE1）裂解淀粉样前体蛋白（Amyl oid precursor protein,APP）产生的产物,抑制BACE1的过度生成从而减少Aβ的产生,是改善AD认知、减缓疾病进展的重要治疗手段。自噬是细胞利用溶酶体降解和回收细胞内衰老和受损的生物大分子与细胞器,在细胞发育、分化、存活和维持内环境稳定中均起到重要作用。线粒体是维持细胞能量代谢的至关重要的细胞器,其新陈代谢的方式就是线粒体自噬。神经元的健康有赖于线粒体以自噬方式清除Aβ等毒性蛋白,线粒体自噬功能障碍贯穿AD的发病及疾病全程。中医理论将AD的病机归纳为本虚标实,脾肾亏虚日久遂至痰瘀阻窍,治疗多以补益药配伍活血化瘀、醒脑开窍药等。石菖蒲是醒脑开窍药的代表药物,具有芳香走窜,开窍醒神的药性,其有效成分分子量小、脂溶性强,在体内吸收快。β-细辛醚是石菖蒲的主要有效成分之一,在既往的实验中课题组发现,β-细辛醚对神经退行性疾病、神经系统肿瘤,以及抑郁症、脑梗塞等都有一定的治疗效果。本文基于BACE1靶点,研究β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠的药效学机制,并进一步研究其对APP/PS1转基因小鼠自噬功能、PINK1/Parkin介导的线粒体自噬功能的影响。本研究主要由四部分实验组成,实验一:研究石菖蒲有效成分β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力、乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）代谢的影响,探讨β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠的药效作用。实验二:研究低中高剂量β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠脑内淀粉蛋白前β-分解酶1（Beta-site APP-Cleaving Enzyme 1,BACE1）、Aβ沉积和 APP、早老素-1（Presenilin-1,PS1）、神经突触素-1（Synapsin I,SYN-1）表达的影响,评价其药效作用。实验三:研究β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠脑内自噬相关因子Beclin-1、p62、LC3Ⅰ/Ⅱ的作用,探讨β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠自噬功能的影响。实验四:研究β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬的影响,探讨β-细辛醚对AD作用的可能机制和靶点。第一部分实验目的:研究石菖蒲主要有效成分β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力的作用。方法:SPF级APP/PS1转基因小鼠50只,雌雄各半,随机分为5组,每组10只,即模型组、β-细辛醚低剂量组、β-细辛醚中剂量组、β-细辛醚高剂量组、多奈哌齐组。另设正常组,APP/PS1基因型为野生型小鼠10只。正常组、模型组予生理盐水,灌胃给药30d。①行为学实验（水迷宫实验、避暗实验、跳台实验）评价APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力;②酶标免疫法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测APP/PS1转基因小鼠大脑皮质中的ACh含量。结果:1.与正常组相比,模型组小鼠在水迷宫实验中游泳时间显著延长（P<0.01）,错误次数显著增加（P<0.001）;避暗潜伏期显著缩短（P<0.001）,避暗错误次数呈增加趋势;跳台潜伏期显著缩短（P<0.001）,跳台错误次数呈增加趋势;皮质ACh含量显著减少（P<0.001）。2.与模型组相比,在水迷宫实验中各用药组游泳时间均减少,其中β-细辛醚中、高剂量组游泳时间减少显著（P<0.001）,各用药组错误次数呈下降趋势。3.与模型组相比,避暗实验中各用药组潜伏期均延长,其中β-细辛醚中、高剂量组潜伏期显著延长（P<0.05,P<0.001）,多奈哌齐组潜伏期明显延长（P<0.001）,各用药组错误次数呈下降趋势,其中β-细辛醚高剂量组错误次数明显减少（P<0.05）。4.与模型组相比,跳台实验中各用药组潜伏期均延长,其中β-细辛醚低、中、高剂量组呈递增趋势,高剂量组潜伏期显著延长（P<0.01）。各用药组错误次数呈下降趋势,β-细辛醚低中高剂量组错误次数均明显减少（P<0.01,P<0.05,P<0.05）,多奈哌齐组错误次数明显减少（P<0.01）。5.与模型组相比,各给药组小鼠皮质ACh明显增加（P<0.05-P<0.001）。其中,β-细辛醚低中高剂量组ACh含量增加均较为明显（P<0.001）。结论:β-细辛醚能提高APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力,其作用机制可能是改善了APP/PS1转基因小鼠大脑皮质中的ACh代谢。第二部分实验目的:基于BACE1研究β-细辛醚对APP/PS1小鼠的药效学靶点方法:SPF级APP/PS1转基因小鼠50只,雌雄各半,随机分为5组,每组10只,即模型组、β-细辛醚低剂量组、β-细辛醚中剂量组、β-细辛醚高剂量组、多奈哌齐组。另设正常组,APP/PS1基因型为野生型小鼠10只。①ELISA检测APP/PS1转基因小鼠海马内APP、PS1、Aβ、BACE1、SYN-1的表达;②实时荧光定量技术（Reverse Transcription-Polymerse Chain Reaction,RT-PCR）检测相关基因:APP mRNA、PS1 mRNA、SYN-1 mRNA、BACE1 mRNA;③蛋白免疫印迹法（Westernblot,WB）检测APP/PS1转基因小鼠海马内BACE1、SYN-1的表达。结果:1.ELISA检测APP/PS1转基因小鼠海马内APP、PS1、Aβ、BACE1、SYN-1的表达与正常组相比,模型组小鼠海马内APP、BACE1、Aβ、BACE1表达显著升高,SYN-1表达显著降低,差异均具有统计学差异（P<0.001）,PS1表达呈上升趋势。与模型组相比,β-细辛醚高剂量组小鼠海马内APP显著减少（P<0.001）。与模型组相比,β-细辛醚中、高剂量组、多奈哌齐组海马内PS1显著减少（P<0.01-P<0.001）。与模型组相比,β-细辛醚低、中、高剂量组、多奈哌齐组海马内Aβ显著减少（P<0.01-P<0.001）。与模型组相比,β-细辛醚低、中、高剂量组、多奈哌齐组海马内BACE1显著减少（P<0.05-P<0.001）。与模型组相比,β-细辛醚中、高剂量组海马内SYN-1显著减少（P<0.001）。2.RT-PCR检测β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠海马内APP mRNA、PS1 mRNA、BACE1 mRNA、SYN-1 mRNA 表达的影响与正常组相比,模型组海马内APP mRNA、BACE1 mRNA表达显著升高（P<0.01）,SYN-1 mRNA表达显著降低,差异具有统计学差异（P<0.01）,PS1 mRNA表达明显上升（P<0.01）。与模型组相比,β-细辛醚低、中、高剂量组以及多奈哌齐组小鼠海马内APP mRNA表达显著降低（P<0.05-P<0.01）。与模型组相比,β-细辛醚低、中、高剂量组以及多奈哌齐组小鼠海马内PS1 mRNA表达显著下降（P<0.05-P<0.01）。与模型组相比,β-细辛醚低、中、高剂量组以及多奈哌齐组小鼠海马内BACE1 mRNA表达显著降低（P<0.05-P<0.01）。与模型组相比,β-细辛醚中、高剂量组小鼠海马内SYN-1 mRNA表达显著增加（P<0.05-P<0.01）。3.WB检测β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠海马内BACE1、SYN-1表达的影响与正常组相比,模型组小鼠海马内BACE1表达呈上升趋势,SYN-1水平下降（P<0.05）。与模型组相比,各用药组海马内BACE1表达呈下降趋势,β-细辛醚高剂量组SYN-1 水平上升（P<0.05）。结论:不同剂量的β-细辛醚均能抑制APP/PS1小鼠海马内APP、PS1的表达,其中高剂量组（30mg/kg·d）β-细辛醚药效最佳,并具有抑制APP/PS1转基因小鼠海马内BACE1表达、增加SYN-1表达的作用。第三部分实验目的:研究β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠自噬功能的影响方法:SPF级APP/PS1转基因小鼠40只,雌雄各半,随机分为4组,每组10只,即模型组、β-细辛醚中剂量组、自噬激活剂抗霉素A（antimycin A,A3）和抑制剂环孢素A（CyclosporinA,CsA）组。另设正常组,APP/PS1基因型为野生型小鼠10只。正常组、模型组予生理盐水,灌胃给药30d。①WB检测APP/PS1转基因小鼠海马内LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、p62 的表达;②RT-PCR检测相关基因:LC3 mRNA、Beclin-1 mRNA、p62mRNA;③IHC检测 APP/PS1 小鼠海马内 LC3、Beclin-1、p62 的表达。结果:1、WB检测β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠海马内LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、p62表达的影响与正常组相比,模型组小鼠海马内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达降低（P<0.01,P<0.05）,p62 表达明显升高（P<0.01）。与模型组相比,β-细辛醚组小鼠海马内LC3Ⅱ/LC31表达明显增加（P<0.001）,A3组小鼠海马内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达明显增加（P<0.001）。与模型组相比,β-细辛醚组小鼠海马内Beclin-1表达呈上升趋势,A3组小鼠海马内Beclin-1表达明显上升（P<0.001）。与模型组相比,β-细辛醚组小鼠海马内p62表达下降（P<0.01）,A3组小鼠海马内p62表达明显下降（P<0.001）,CsA组小鼠海马内p62明显上升（P<0.001）。2、RT-PCR检测β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠海马内Beclin-1 mRNA、p62 mRNA、LC3mRNA表达的影响与正常组相比,模型组小鼠海马内LC3 mRNA显著下降（P<0.01）、Beclin-1 mRNA表达呈下降趋势,p62 mRNA表达呈上升趋势。与模型组相比,β-细辛醚小鼠与A3组小鼠海马内LC3 mRNA表达升高（P<0.001）。与模型组相比,β-细辛醚小鼠与A3组小鼠海马内Beclin-1 mRNA表达升高（P<0.05）,CsA 组表达降低（P<0.05）。与模型组相比,β-细辛醚小鼠海马内p62 mRNA表达呈降低趋势,A3组小鼠海马内p62 mRNA表达明显降低（P<0.05）,CsA组小鼠海马内p62 mRNA表达呈上升趋势。3、IHC检测β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠海马内Beclin-1、p62、LC3表达的影响与正常组相比,模型组小鼠海马内LC3、Beclin-1表达降低（P<0.05,P<0.001）,p62表达明显升高（P<0.05）。与模型组相比,β-细辛醚组与A3组小鼠海马内LC3表达明显增加（P<0.001）。与模型组相比,β-细辛醚组与A3组小鼠海马内Beclin-1表达明显上升（P<0.001）。与模型组相比,β-细辛醚组小鼠海马内p62表达下降（P<0.05）,A3组小鼠海马内p62表达明显下降（P<0.01）。结论:1、APP/PS1转基因小鼠自噬功能较正常野生型小鼠明显受到抑制。2、β-细辛醚能够激活APP/PS1转基因小鼠自噬,促进LC3、Beclin-1表达、抑制p62的表达。第四部分实验目的:研究β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬的影响。方法:SPF级APP/PS1转基因小鼠40只,雌雄各半,随机分为4组,每组10只,即模型组、β-细辛醚中剂量组、线粒体自噬激活剂抗霉素A（antimycin A,A3）和线粒体抑制剂环孢素A（CyclosporinA,CsA）组。另设正常组,APP/PS1基因型为野生型小鼠10只。正常组、模型组予生理盐水,灌胃给药30d。①RT-PCR检测APP/PS1转基因小鼠海马及皮质中PINK1 mRNA、Parkin mRNA的表达;②IHC检测APP/PS1转基因小鼠海马及皮质中PINK1、Parkin的表达。结果:1、RT-PCR检测β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠海马内PINK1 mRNA、Parkin mRNA表达的影响与正常组相比,模型组小鼠海马内PINK1显著下降（P<0.01）,Parkin mRNA表达呈上升趋势。与模型组相比,β-细辛醚组与A3组小鼠海马内PINK1 mRNA表达显著上升（P<0.01-P<0.001）,与模型组相比,β-细辛醚组与A3组小鼠海马内Parkin mRNA表达下降（P<0.05）,CsA组小鼠海马内Parkin mRNA表达呈上升趋势。2、IHC检测β-细辛醚对APP/PS1转基因小鼠海马内PINK、Parkin表达的影响与正常组相比,模型组小鼠海马内PINK1与Parkin表达均明显下降（P<0.01）。与模型组相比,β-细辛醚组小鼠海马内PINK1表达明显上升（P<0.001）,A3组小鼠海马内PINK1表达上升（P<0.001）。与模型组相比,β-细辛醚组小鼠海马内Parkin表达上升（P<0.01）,A3组小鼠海马内Parkin明显表达上升（P<0.001）。结论:1.APP/PS1转基因小鼠的线粒体自噬功能较野生型小鼠明显受到抑制。2.β-细辛醚激活APP/PS1小鼠PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,可能为β-细辛醚对APP/PS1小鼠药效作用的机制之一。总结论:1、β-细辛醚能有效提高APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力,其机制可能与改善ACh代谢有关。2、低中高剂量的β-细辛醚均能抑制APP/PS1转基因小鼠海马内APP、PS1、Aβ、BACE1表达,提高SYN1表达,其中以高剂量组（30mg/kg·d）效果最明显。3、APP/PS1转基因小鼠的自噬功能较正常小鼠明显受到抑制,β-细辛醚能促进APP/PS1小鼠自噬,提高LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1表达、抑制p62的表达,提示β-细辛醚可能通过促进APP/PS1转基因小鼠的自噬功能起到药效作用。4、β-细辛醚促进APP/PS1转基因小鼠PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。