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第一部分:羟考酮对大鼠脓毒症急性肺损伤的影响目的 采用静脉注射脂多糖(LPS)的方法复制大鼠脓毒症急性肺损伤(ALI)模型,观察大鼠动脉血气、肺组织通透性指数、肺病理组织学的改变,并检测肺组织水通道蛋白AQP-1、AQP-5,Toll样受体4(TLR4)及核转录因子(NF-κB)的表达水平,以探讨羟考酮对大鼠急性肺损伤可能的保护机制。方法 健康雄性SD大鼠36只,体重250～300 g,随机分为3组(n=12):假手术组(S组)、急性肺损伤组(A组)和羟考酮预先给药组(O组)。A组和O组采用静脉注射LPS 8 mg/kg建立急性肺损伤模型。S组注射等容量生理盐水,O组于注射LPS前10 min静脉注射羟考酮2 mg/kg,S组和A组分别注射相应容积的生理盐水。LPS注射后6 h采集股动脉血1 ml进行动脉血气分析。LPS注射后6h处死大鼠,收集支气管肺泡灌洗液(BALF),测定肺通透性指数(LPI),用ELISA法测定血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的浓度;取肺组织,测定肺组织湿/干重比值(W/D),光镜下行病理学损伤评分,免疫蛋白印记法检测AQP-1、AQP-5、TLR4及NF-κB蛋白的表达。结果 与S组比较,A组动脉血氧分压及氧合指数明显下降,血浆TNF-α和IL-1β浓度,肺组织W/D比值、LPI、病理学损伤评分以及肺组织TLR4、NF-κB表达水平均升高,AQP-1、AQP-5表达水平降低(P<0.05);与A组比较,O组大鼠动脉血氧分压及氧合指数升高,血浆TNF-α和IL-1β的浓度,肺组织W/D比值、病理学损伤评分以及肺组织TLR4、NF-κB表达水平均降低,AQP-1、AQP-5表达水平升高(P<0.05)。结论(1)羟考酮可改善急性肺损伤大鼠肺微血管通透性,减轻肺水肿,其机制可能与上调AQP-1、AQP-5的表达有关;(2)羟考酮可减轻急性肺损伤大鼠肺组织的炎症反应,可能与抑制TLR4及NF-κB的表达有关。第二部分:miR-140在脓毒症急性肺损伤中的表达及其调控炎症反应机制的研究目的 从体内和体外实验两个方面探讨微小RNA-140(miR-140)在脓毒症急性肺损伤的差异表达及其与炎性因子表达的相关性。方法 30只雄性SD大鼠随机等量分为5组:假手术组(sham组),ALI 3h、6h、12h及24h组。股静脉注射LPS 8 mg/kg构建脓毒症ALI模型。采用LPS(浓度2ug/L)诱导人肺Ⅱ型上皮细胞(A549)损伤,建立脓毒症ALI细胞模型。细胞分为五组:空白对照组(NC组)和LPS3h、6h、12h及24h组。于各时间点观察大鼠肺组织病理学改变,检测大鼠血浆以及A549细胞中miR-140和TNF-α、IL-1β表达水平,并分析两者相关性;检测大鼠肺组织miR-140和TLR4表达水平,并分析两者相关性。采用软件Targetscan和RNAhybrid数据库对miRNA-140进行靶基因预测,构建双荧光素酶重组载体,并将此重组质粒与miR-140共转染A549细胞,利用双荧光素酶报告基因系统检测miR-140对TLR4转录活性的影响。构建TLR4过表达质粒,并将此质粒与miR-140共转染A549细胞,Western blotting检测细胞中TLR4及NF-κB蛋白的表达。结果(1)与对照组相比,ALI大鼠血浆TNF-α、IL-1β浓度明显增高,miR-140的表达显著下调,miR-140与IL-1β、TNF-α水平亦均呈负相关(P<0.05);(2)ALI大鼠肺组织TLR4表达增强,miR-140的表达下调,两者呈负相关;(3)LPS处理的A549细胞中miR-140、IL-1β、TNF-α变化趋势与ALI大鼠中趋势一致;(4)双荧光素酶报告结果以及restore实验显示:TLR4可能是miR-140的靶基因。结论(1)在脓毒症急性肺损伤动物和细胞模型中,miR-140表达显著下调;(2)TLR4可能是miR-140的靶基因;(3)miR-140通过负向调控TLR4的表达,减轻急性肺损伤中的炎症反应。第三部分:miR-140调控Toll like receptor 4信号通路在脂多糖诱导肺上皮细胞损伤中的作用目的 在体外模拟脓毒症急性肺损伤(ALI)的模型,观察miR-140对TLR4-TRAF6-NF-κB信号通路的调控机制以及对细胞凋亡的影响,探讨其对急性肺损伤的保护作用。方法 将体外培养的人肺Ⅱ型上皮细胞(A549),分别转染miR-140 mimic或miR-140 inhibitor 48小时,然后给予终浓度为2 μg/ml的LPS诱导肺上皮细胞损伤。实验分为三组:(1)对照组(CON组):不加任何试剂;(2)LPS组:加入终浓度为2 μg/ml的LPS;(3)miR-140 mimic组(MI组):先转染miR-140 mimic,后加入LPS;(4)空白mimic组(NC组):先转染negativecontrol,后加入LPS(5)miR-140 inhibitor组(IN组):先转染miR-140 inhibitor,后加入LPS;加入LPS继续培养24h后分别收集各组细胞及上清液进行相关指标检测。利用实时定量PCR检测各组目标基因mRNA表达水平,Western blotting检测目的蛋白的表达。采用TUNEL染色以及流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 与CON组比较,LPS组细胞内miR-140表达下调,细胞凋亡率明显增高(P<0.05);与LPS组比较,miR140-mimic组细胞内miR-140表达上调,细胞凋亡率明显降低,细胞内TLR4、NF-κB、TRAF6、RIP、Caspase-3蛋白表达降低,XIAP、SCOS-3 蛋白表达增强(P<0.05),TLR4、TRAF6、RIP、XIAP 的 mRNA 表达具有与蛋白表达相似的变化趋势;与LPS组比较,miR140-inhibitor组细胞内miR-140表达下调,细胞凋亡率升高,TLR4、NF-κB、TRAF6、RIP、Caspase-3蛋白表达增强,XIAP、SCOS-3 蛋白表达降低(P<0.05),TLR4、TRAF6、RIP、XIAP 的 mRNA 表达具有与蛋白表达相似的变化趋势;与LPS组比较,negativecontrol组目标蛋白的表达以及细胞凋亡率无明显改变。结论(1)miR-140通过负调控TLR4-TRAF6-NF-κB信号通路抑制细胞凋亡,从而对脂多糖诱导的肺上皮细胞损伤起保护作用。(2)上调miR-140或抑制TLR4-TRAF6-NF-κB信号通路的激活有望成治疗急性肺损伤相关性疾病的有效靶点。