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禽致病性大肠杆菌（Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC）作为典型的肠道外病原菌具有广泛的宿主谱,严重危害养禽业的发展。作为一类人畜共患菌的潜在储库,APEC可能会对人类健康造成威胁,因此开展APEC致病机制的研究具有潜在的公共卫生学意义。外膜囊泡（Outer Membrane Vesicle,OMV）是一种由革兰氏阴性菌自然分泌的、具有双层蛋白脂结构的球形囊泡。前期有研究证明OMV作为病原菌极为重要的毒力载体,可携带关键毒力因子通过内吞作用进入感染宿主细胞内,提高源细菌的致病力及破坏力。但禽致病性大肠杆菌外膜囊泡（APEC-OMV）是否可作为APEC的毒力因子载体,其蛋白组分在APEC感染宿主细胞过程中是否是随机包装的,其中的某些关键毒力因子在脱离OMV后是否依旧具有毒力作用,诸如此类问题仍有待进一步研究。为了探究上述问题,本研究以APEC-OMV为研究对象,以筛选其关键毒力因子并阐明关键毒力因子致宿主细胞凋亡的分子机制为研究目标。将APEC临床分离株AE17与宿主细胞鸡气管黏膜上皮细胞（Chicken trachea epithelium cells,CTECs）共培养前后OMV进行蛋白组学差异分析,结合前期研究筛选毒力因子外膜蛋白A（Outer membrane protein A,Omp A）为切入点,构建omp A基因缺失株和过表达株,建立APEC-OMV感染CTECs细胞模型,探究omp A基因对APEC-OMV对宿主细胞凋亡机制的影响;将真核质粒pCMV-Myc和重组载体pCMV-Myc-Omp A分别转染CTECs,进行免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）及质谱分析,探究其对CTECs调控通路的影响。通过本研究的开展,筛选APEC-OMV的关键毒力因子,并明确其致CTECs凋亡的下游靶蛋白。主要研究内容及结果如下:1、基于蛋白质组学筛选APEC与CTECs共培养前后OMV的差异蛋白分别从禽致病性大肠杆菌AE17菌液上清和菌液与CTECs共培养2 h后的培养基中提取纯化OMV,利用非定量标记法（Label-free）对两组APEC-OMV进行质谱检测和生物信息学分析。结果发现,与APEC菌液中提取的OMV相比,APEC菌液与CTECs共培养后提取的OMV有605个差异蛋白。这些差异蛋白主要涉及能量产生和转化、细胞周期控制和细胞分裂、核肽运输和新陈代谢、碳水化合物转运与代谢等多种信号途径。根据GO功能注释和KEGG通路分析可知,这些差异蛋白富集于碳代谢、核糖体和氧化磷酸化等信号通路。这些结果表明,APEC与CTECs共培养后可能在翻译水平上影响呼吸链或核糖体中的蛋白质或酶从而调节OMV的蛋白组成,对OMV的致病作用具有一定调控作用。2、omp A基因在APEC-OMV致CTECs凋亡作用中的功能本论文作者所在课题组前期研究发现Omp A是APEC-OMV中表达丰度最高的外膜蛋白,可导致CTECs中部分天然免疫基因表达水平发生显著变化,进而锚定Omp A开展后续实验。本试验以禽致病性大肠杆菌AE17菌株为野生株,利用CRISPR/Cas 9系统构建omp A基因缺失株,利用表达载体pET-28a构建空载株和omp A基因过表达株,分别提取原始株、缺失株、空载株及过表达株的OMV。透射电镜观察和纳米颗粒分析发现,与原始株OMV相比,缺失株OMV产生数量明显减少且粒径主峰降低,而过表达株OMV产生数量有所提高且粒径主峰增高。Annexin V-FITC/PI双染后经流式分析仪测定和荧光显微镜观察,结果发现与正常培养的细胞相比,原始株、缺失株、空载株及过表达株OMV感染CTECs后细胞在早期和晚期凋亡数量均增加。其中与原始株OMV相比,缺失株OMV对CTECs凋亡的诱导作用有所降低,过表达株OMV感染CTECs后细胞凋亡数量相对最多。透射电镜观察4株菌株OMV感染CTECs后的超微病理切片,结果发现过表达株OMV感染后的CTECs呈现显著病变,如线粒体基质变淡、嵴消失甚至转化为小泡状结构等。以上实验结果进一步明确了omp A基因对APEC-OMV产生的数量和粒径主峰具有正调控作用且促进APEC-OMV诱导CTECs细胞凋亡。3、毒力因子Omp A致CTECs凋亡的下游靶蛋白筛选将真核质粒pCMV-Myc与重组载体pCMV-Myc-Omp A分别转染CTECs培养24 h,结果发现毒力因子Omp A可促进CTECs发生早期和晚期凋亡。透射电镜观察结果发现相比于空白组和对照组,毒力因子Omp A转染后的CTECs病理变化显著如线粒体变大变圆、基质变淡、嵴变短变少甚至消失等。毒力因子Omp A转染后的CTECs通过Co-IP和质谱分析发现15种差异蛋白,主要参与蛋白质结合、异构酶活性等生物学功能和T细胞活化、细胞-细胞黏附介质活性等细胞组成过程。基于String数据库筛选可能与Omp A互作的蛋白有6种,即PGK1（3-磷酸甘油酸激酶）、PKM2（丙酮酸激酶）、EEF1A1（延伸因子1-alpha 1）、ACTG1（肌动蛋白细胞质5型）、FSCN1（肌动蛋白束蛋白-1）、PABPC1（聚腺苷酸结合蛋白-1）。这一实验结果表明毒力因子Omp A对宿主细胞CTECs具备一定的致病作用。综上所述,本研究发现APEC与宿主细胞CTECs共培养2 h前后提取纯化的OMV蛋白组成存在差异,筛选毒力因子Omp A为研究对象,成功构建omp A基因缺失株和过表达株,发现omp A基因对APEC-OMV的形成具有正向调节功能且促进APEC-OMV诱导CTECs细胞凋亡。同时,本研究结合Co-IP及质谱分析初步筛选了毒力因子Omp A致CTECs凋亡的下游靶蛋白,为进一步深入研究APEC-OMV的致病机制提供了一条新的途径。