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Whirly蛋白是植物所特有的双定位的转录因子,它可以响应环境刺激,并调控细胞核基因的表达来使植物对逆境产生一定的抗性。温度胁迫是番茄栽培中的主要障碍因素之一,探讨Whirly蛋白在低温胁迫下的生理功能对于揭示番茄等喜温蔬菜的耐冷机制具有重要的理论意义和实践价值。本实验克隆了一个番茄叶绿体和细胞核双定位的Whirly蛋白基因(LeWhy1),以正义、反义转基因番茄植株为材料,研究了LeWhy1在低温胁迫中的功能。主要结果如下:(1)根据NCBI查得该基因的全长mRNA序列(GenBank注册号:JQ670889),DNAman设计特异引物,提取番茄叶片RNA,通过RT-PCR获得LeWhy1的全长cDNA,全长807bp,编码268个氨基酸。(2)将p35S-LeWhy1-GFP融合蛋白在拟南芥原生质体进行瞬时表达,用Confocal观察发现GFP绿色荧光和叶绿素自发荧光完全重合,说明Le Why1蛋白是叶绿体定位的;观察转p35S-Le Why1-GFP基因稳定表达的烟草的细胞发现LeWhy1蛋白既定位于叶绿体又定位于细胞核。(3)qRT-PCR分析表明,LeWhy1基因在叶绿素含量高的组织(叶片)中表达量较高。同时该基因的表达受低温、高温、NaCl、PEG、SA、GA和ABA的诱导。(4)将LeWhy1的编码区连入pBI121载体,构建了过表达和抑制LeWhy1表达的载体。利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,获得正、反义转基因番茄植株,并通过PCR、qRT-PCR方法检测具有卡那抗性的转基因植株,结果表明成功获得了LeWhy1过表达和抑制表达的转基因番茄植株。(5)低温胁迫下,过表达LeWhy1植株与野生型和抑制LeWhy1表达的番茄植株相比,表现出较低的细胞膜受伤害程度,较低的O2?-和H2O2含量,并维持较高的APX、CAT、POD酶活性,说明过表达LeWhy1基因提高了番茄植株的抗低温胁迫能力。(6)高通量转录组测序分析结果表明,LeWhy1调控表达的基因在光合作用通路以及植物病原响应的通路中最多。受LeWhy1调控较显著的基因主要包括一些胁迫响应基因、核酸外切酶、细胞能量相关基因、蛋白运输相关基因等,它们有些定位于细胞核中,有些定位于叶绿体中,这与LeWhy1的细胞核、叶绿体的双定位是相适应的。(7)受低温调控较显著的基因主要包括编码种子成熟蛋白LEA4、IST1同系物、锌指蛋白类、细胞色素P450、热激蛋白、乙烯响应因子、谷胱甘肽转移酶类等蛋白的基因。受低温调控比较显著的转录因子主要包括正调控的三螺旋转录因子、热激转录因子、乙烯响应转录因子、WRKY转录因子。(8)从443个新基因中筛选出两个受LeWhy1基因调控较显著的基因。分别位于9号和11号染色体上,正调控的基因编码的蛋白能与环状化合物结合,负调控的基因定位于叶绿体及线粒体,作为转录因子,可与核酸结合,调控基因的表达。其具体作用机制有待进一步研究。