【摘 要】
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背景颞下颌关节（temporomandibular joint,TMJ）对生物力刺激很敏感,咬合是其主要来源。髁突软骨从浅及深可分为:纤维层、增殖层、成熟层、肥大层和钙化软骨层。前期我课题组建立了异常咬合模型-单侧前牙反（unilateral anterior crossbite,UAC）模型,观察到TMJ软骨退行性改变;双侧前牙咬合抬高模型（bilateral anterior elevati
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背景颞下颌关节（temporomandibular joint,TMJ）对生物力刺激很敏感,咬合是其主要来源。髁突软骨从浅及深可分为:纤维层、增殖层、成熟层、肥大层和钙化软骨层。前期我课题组建立了异常咬合模型-单侧前牙反（unilateral anterior crossbite,UAC）模型,观察到TMJ软骨退行性改变;双侧前牙咬合抬高模型（bilateral anterior elevation,BAE）,观察到浅层软骨细胞大量增殖现象。本研究拟采取在体基因修饰技术进行研究,进而深入了解下颌髁突软骨浅层及深层细胞对异常咬合UAC及BAE的生物学响应规律,为阐述软骨退变规律提供细胞生物学基础。目的1.利用Cre-loxp基因修饰技术,示踪TMJ软骨细胞,观察UAC和BAE刺激下Sox9+浅层和Col10+深层软骨细胞的不同响应特征;2.利用DTA细胞定向敲除技术,敲除Sox9+浅层或Col10+深层软骨细胞,观察髁突软骨对UAC及BAE刺激的响应变化。方法1.利用Sox9/Col10-CreERT2工具鼠分别与Rosa26/td Tomato工具鼠杂交得到Sox9/Col10-Cre ERT;R26RTd T（54/45只）的6周龄雌性小鼠（n=6/5）,注射Tamoxifen（TAM）后施加UAC或BAE,在第1、4、7周末取髁突软骨,分别记为Sox9-Td T组和Col10-Td T组,通过组织免疫荧光染色,观察Td T标记细胞变化。2.利用Sox9/Col10-CreERT2工具鼠分别与Rosa26/DTA工具鼠杂交得到Sox9/Col10-Cre ERT;R26RDTA（54只、36只）雌性小鼠（6周龄）。施以UAC或BAE,Sox9组于第1、4、7周开始时注射TAM,第3周（n=3）、7周（n=6）末取材;Col10组于第4、7周开始时注射TAM,第7周末（n=6）取材,分别记为Sox9-DTA组和Col10-DTA组。运用Micro-CT成像,冯库萨、HE、番红O、免疫组化染色,透射电镜方法,观察敲除浅层或深层软骨细胞后对UAC、BAE刺激的响应。结果1.在UAC刺激下,Sox9-Td T组荧光双标的Sox9-Td T+Col-X+/OCN+/DMP-1+/Adipo Q+软骨细胞数量明显增加;在BAE刺激下,Sox9-Td T+Col-X+/OCN+/DMP-1+/Adipo Q+软骨细胞数量显著减少。2.在UAC刺激下,Col10-Td T组Col10-Td T+OCN+/DMP-1+/Adipo Q+软骨细胞阳性率显著增加,Col10-Td T+Sox9+明显减少;在BAE刺激下,Col10-Td T+Sox9+/OCN+/DMP-1+/Adipo Q+软骨细胞阳性率均大量减少。3.敲除Sox9+浅层软骨细胞可使软骨细胞丧失增殖能力,加重UAC引起的软骨细胞分化加速、软骨变薄、细胞凋亡等病变;降低BAE促进软骨细胞增殖、软骨增厚作用,使软骨变薄。4.敲除Col10+深层软骨细胞可加剧UAC引起的分化加速、软骨变薄、软骨细胞凋亡等病变;影响BAE促进软骨细胞增殖、软骨增厚作用。结论1.髁突Sox9+浅层软骨细胞具有增殖和成熟分化能力,定向杀死Sox9+浅层软骨细胞将导致深层软骨和软骨下骨发育不良,加剧UAC引起的软骨退变,而使BAE丧失促软骨增殖的作用。2.髁突Col10+深层软骨细胞具有终末分化能力,定向杀死Coll0+深层软骨细胞将破坏软骨下骨的形成和浅层软骨细胞的功能环境,导致髁突变形和浅层软骨细胞凋亡,加剧UAC引起的软骨退变,影响BAE促软骨增殖的作用。
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