乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一,近年来以来,乳腺癌的发病率一直呈上升趋势,全球每年约有100万妇女被诊断为乳腺癌,近年以来,我国乳腺癌的发病率快速上升,已经成为我国女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。乳腺癌细胞的转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因之一,在临床诊断时,约有10%的患者已经发生远端转移,一旦发生转移,预后较差,5年生存率仅为20%。因此,深入研究与乳腺癌转移相关的信号通路,明确通路中的受体和效应分子之间的调控方式和特点,对于阐明乳腺癌转移的机制意义重大。叉状头转录因子Foxp3作为乳腺癌的抑制基因,近年来受到越来越多的关注。研究表明,在正常乳腺上皮细胞中存在Foxp3的表达,而在乳腺癌组织中,Foxp3低表达甚至缺失;Foxp3在乳腺癌中表达水平的下降导致了多种乳腺癌相关癌基因的表达调控异常,进而促进了乳腺癌的发生发展;Foxp3基因突变的小鼠患乳腺肿瘤的几率明显增高,且对致癌物质的敏感性增加;进一步的实验证明,Foxp3可以通过抑制癌基因HER-2/Erb B2,SKP2的表达抑制乳腺癌细胞的增殖。因此,Foxp3是乳腺癌发生发展的重要的抑制基因,其功能及信号转导通路的阐明将为乳腺癌的发生发展提供重要的线索,为乳腺癌的治疗提供新的方法。尽管大量的研究表明Foxp3能够抑制乳腺癌的增殖,然而对于Foxp3在乳腺癌转移中的功能却鲜有报道。Overbeck-Zu等研究发现,在乳腺癌中Foxp3的低表达会促进肿瘤细胞趋化因子驱动的转移,提示Foxp3可能会抑制乳腺癌的转移,但机制尚不清楚,仍有很多问题有待深入探讨:1、在乳腺癌临床标本中,Foxp3表达水平的变化与乳腺癌的转移有无相关性?2、作为转录因子,Foxp3在乳腺癌细胞中可以调控那些转移相关基因的表达?3、Foxp3调控这些分子表达的机制是怎样的呢?4、上调Foxp3表达后,能否抑制乳腺癌动物模型中肿瘤细胞的转移?上述问题的回答有助于阐明Foxp3抑制乳腺癌转移的机制,将丰富Foxp3作为乳腺癌抑制基因的功能。为此,我们进行了下列研究工作:①首先利用组织芯片技术,分析221例乳腺癌临床标本中Foxp3的表达水平,统计了其在正常乳腺组织及不同临床分期的乳腺癌中的表达水平的差异,从而鉴定Foxp3的表达水平与乳腺癌转移的关系。②其次,为了确认Foxp3通过对哪些分子表达的调控从而参与了乳腺癌的转移,我们还通过免疫组织化学、实时定量PCR、Western Blot分析了乳腺癌临床标本及乳腺癌细胞株中Foxp3与细胞黏附分子CD44表达水平之间的关系。③继而,为了验证Foxp3能否抑制乳腺癌中CD44的表达,我们选用两株低表达Foxp3的细胞系SKBr-3、MDA-MB-231,瞬时转染Foxp3;选用两株高表达Foxp3的细胞系MCF-7、T47D,采用si RNA技术干涉掉内源的Foxp3,利用Western Blot,实时定量PCR观察CD44表达水平的改变。④为了观察Foxp3和CD44在细胞水平表达的相关性,采用流式分析技术,分别收集高表达/低表达CD44的MDA-MB-231细胞亚群,运用细胞免疫荧光技术分析两个不同细胞亚群中Foxp3的表达水平。⑤运用了双荧光素酶报告基因、染色质免疫沉淀分析(CHIP)和电泳迁移率实验(EMSA)来阐明Foxp3调控CD44表达的机制。⑥利用Transwell和细胞黏附实验明确Foxp3能否通过调控CD44的表达来影响乳腺癌细胞的黏附和侵袭能力。⑦最后,利用动物活体成像技术证实在体内环境中Foxp3能否抑制乳腺癌的肺转移。通过以上实验我们得到了下列结果:①通过组织芯片技术发现,与正常乳腺组织相比,Foxp3在已发生转移的乳腺癌组织中的表达量显著下降,这说明Foxp3与乳腺癌的转移有密切的关系。Foxp3在乳腺癌细胞中表达水平的降低或者缺失可能是导致乳腺癌发生转移的重要原因。②应用SPSS 13.0软件分析发现,CD44和Foxp3的表达水平在乳腺癌组织中呈负相关,提示两者之间的关系密切,Foxp3可能是CD44表达的抑制基因。③通过上调乳腺癌细胞中Foxp3的表达量,发现CD44的表达水平随之降低;而当干涉掉Foxp3后,则能促进CD44的表达。从而明确了在乳腺癌细胞中Foxp3能够调控CD44的表达。④细胞免疫荧光实验明确了Foxp3和CD44蛋白在细胞内的分布与定位,并进一步证实了CD44的表达受到了Foxp3的调控。⑤运用流式细胞分选技术证实在MDA-MB-231细胞中,高表达CD44细胞亚群的Foxp3表达水平低于低表达CD44的细胞亚群。⑥通过双荧光素酶报告基因技术证实了Foxp3能够影响CD44启动子的活性;并通过构建启动子截短体的方法明确了Foxp3在CD44启动子上的核心调控区。⑦CHIP实验证实在细胞内Foxp3能够同CD44的启动子结合。⑧EMSA实验进一步明确了Foxp3与CD44启动子的结合作用。⑨通过尾静脉注射方法建立裸鼠的乳腺癌肺转移模型,运用动物活体成像技术证实过表达Foxp3能够抑制乳腺癌在体内的肺转移。在本研究中,我们首次证实了Foxp3能够通过调控CD44启动子的转录活性,进而抑制CD44在乳腺癌中的表达,在乳腺癌的转移中发挥重要的作用。该研究结果完善和补充了Foxp3作为乳腺癌抑制基因的的功能,同时明确了CD44在乳腺癌中过表达的分子机制,为进一步阐明乳腺癌的转移机制提供了新的思路,为乳腺癌的临床治疗提供了新的靶点和方法。