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microRNA(miRNA)为一类长约22nt的非编码小RNA,是转录后基因沉默的重要调节因子,其成熟体miRNA与多种蛋白质因子结合组装形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)后,通过与目标mRNA的3′UTR一个或多个位点不紧密的配对结合形成双链RNA,从而诱导靶mRNA降解或抑制其翻译过程。miRNA广泛存在于各生物中,调节生物体细胞分化、增殖和凋亡等过程,在动物睾丸发育和精子生成过程中发挥着重要的调控作用。本研究根据前期高通量测序结果,选取在沙子岭猪睾丸组织不同发育阶段特异性表达的miR-362作为研究对象,预测其靶基因并进行功能预测,随后对其靶基因进行验证,以研究其在猪睾丸发育和精子生成过程中的调控机制。1、采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测miR-362在沙子岭猪睾丸组织7个发育时期(D1、D30、D60、D90、D120、D150、D180)表达量及其在D30时期的组织表达谱。结果显示,miR-362在沙子岭猪睾丸组织发育时期整体呈现出先下降后上升的表达趋势,其中在D30时期表达量最高,在D150时期表达量最低,表明miR-362在猪睾丸组织中表达具有时序特异性;组织表达谱中结果显示除了在脾脏和肌肉组织中外,D30时期的其他组织中表达量都相对平稳,表明miR-362在猪各组织中表达具有特异性。2、对miR-362进行生物信息学分析,利用miRanda、TargetScan、PicTar等软件预测miR-362靶基因,对靶基因集合进行GO分析及KEGG通路分析,并通过分析miR-362与靶基因3′UTR结合位点保守性分析,选出保守性高的CYLD、CENPK、USP15、RMI1、STRN3、OLIG3、GPR180、PLAGL2、RIMS4、ZNF644、PIK3CA、GADD45A作为候选靶基因。3、在猪睾丸细胞系(swine testis cell,ST)中过表达和抑制表达miR-362,分别检测miR-362及预测的12个靶基因表达量,结果显示,过表达/抑制表达miR-362的ST细胞中miR-362表达量极显著高于/低于NC组和空白组中表达量;转染miR-362mimics的ST细胞中PIK3CA、STRN3及RMI1表达量显著低于NC组和空白组(P<0.05),ZNF644表达量则极显著低于其余二组(P<0.01);转染miR-362 inhibitor细胞中PIK3CA和STRN3表达量显著高于NC组及空白组(P<0.05),ZNF644和RMI1表达量极显著高于其余二组(P<0.01);PIK3CA、STRN3、RMI1及ZNF644为miR-362潜在靶基因。4、分别检测PIK3CA、STRN3、RMI1及ZNF644在睾丸组织7个不同发育时期表达量并与miR-362表达量进行相关性分析。结果显示,miR-362在沙子岭猪睾丸组织发育时期整体呈现出先下降后上升的表达趋势,而PIK3CA、STRN3、RMI1和ZNF644则随着沙子岭猪生长发育表达量呈先上升后下降的趋势;miR-362与PIK3CA、STRN3、RMI1和ZNF644相对表达量的相关系数(r)分别为-0.512(P<0.05)、-0.618(P<0.01)、-0.685(P<0.01)、-0.723(P<0.01),均具有显著的负相关关系。5、选取睾丸组织不同发育阶段中与miR-362表达量具有最大负相关的ZNF644(r=-0.723,P<0.01)作为双荧光素酶报告检测基因,构建psi-CHECK2-ZNF644-3′UTR-WT/MUT载体,将载体与miR-362 mimics/mimics NC共转染至ST细胞系检测细胞荧光素酶活性。结果显示,ZNF644野生型载体+miR-362mimics组荧光素酶活性显著低于ZNF644野生型载体+mimics NC组(P<0.01);而ZNF644突变型载体+miR-362 mimics组与ZNF644突变型载体+mimics NC组荧光素酶活性无显著差异(P>0.05),表明miR-362具有能靶向结合ZNF644 3′UTR并调控其表达的功能。综上,ZNF644为miR-362靶基因,二者在沙子岭猪睾丸组织中表达量呈现出时序特异性;miR-362能抑制ST细胞及沙子岭猪睾丸组织中ZNF644的表达,且其抑制作用随着沙子岭猪睾丸发育而减弱,在沙子岭猪性成熟期抑制作用又加强;生物信息学分析结果显示,miR-362参与调控细胞分化、凋亡、增殖及机体生长发育相关的Notch和Wnt信号通路。综合以上实验结果,miR-362及其靶基因ZNF644可能在猪睾丸发育或精子生成过程发挥重要调控作用。