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一、前言骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种老年中最常见的慢性关节疾病,主要累及手、髋、膝、足、脊柱等重要关节部位,主要表现为关节僵硬、活动受限、疼痛等。引起OA的病因非常复杂,主要包括遗传、性别、创伤、年龄、肥胖、饮食习惯等。OA是累及软骨、软骨下骨及滑膜甚至整个关节的疾病,其病理改变表现为关节软骨退变、软骨下骨骨重塑和血管形成、骨赘形成、滑膜炎症等。目前认为关节软骨层可能是最先发生病理改变的地方,其可能受滑膜和软骨下骨产生的炎症因子刺激后功能发生紊乱。目前尚缺乏治愈OA的手段,现在的治疗方案主要为减轻疼痛、改善关节活动度和减少关节功能受损。在OA终末期病人需要负担昂贵的费用进行手术治疗,加上中国人口老龄化的压力,因而OA已经为社会带来沉重的负担。随着分子生物学、细胞生物学、临床医学等学科的发展和交叉渗透,基因靶向治疗OA已成为研究的热点。基因治疗主要是通过基因测序或基因芯片等方法发现某基因在OA的发病进程中异常表达,然后将外源正常基因导入靶细胞,改善靶细胞的基因缺陷或过表达状况,或使靶细胞获得新的生物功能从而实现更加精准的治疗OA的目标。本课题组在早前研究中发现Postn基因在大鼠软骨下骨中表达上调。后来,Sittisak Honsawek发现,POSTN蛋白在OA病人的血清及关节滑液中同样是高表达的。近期研究表明,POSTN被认为是促进肝硬变的重要因素,并通过促进SMAD2/3通路的磷酸化;而在缺氧情况下,POSTN能抑制SMAD2/3通路的磷酸化。这提示POSTN蛋白可能在参与调控SMAD2/3通路中起着重要的作用。而TGF-β/SMAD信号通路在调控软骨细胞的增殖、分化、凋亡等代谢活动中起着重要作用。SMAD是TGF-β下游的靶蛋白,在软骨发育中,SMAD1/5/8通路促进软骨的成熟,SMAD2/3通路则维持软骨的稳态。但在OA发生时,SMAD1/5/8通路促进软骨退变,而异常的SMAD2/3通路同时能促进软骨退变。同时有研究表明TGF-β能上调OA软骨细胞中Mmp13的表达;TGF-β/SMAD3下调miR-140从而促进Mmp13和Adamts5的表达;并且高表达的SMAD3可促进Mmp13的表达。同时,有学者在上皮鳞癌细胞、乳腺癌细胞、牙周韧带和成骨细胞等其他组织亦发现SMAD3促进Mmp13分泌。因此,TGF-β/SMAD信号通路的活动对维持软骨细胞的正常代谢、结构稳定起着非常重要的作用。二、目的本实验通过检测Postn在OA患者与DMM小鼠关节软骨中的表达情况,并在ATDC5软骨前体细胞中检测Postn在软骨退变过程中的作用;随后构建沉默Postn基因的慢病毒,并通过对DMM小鼠进行关节腔内注射慢病毒,检测软骨细胞上沉默Postn对OA形态结构学及生物功能学的变化情况;最后,通过体外实验检测Postn是否通过介导TGF-β/SMAD3信号通路引起软骨退变进而加重OA。本研究旨在通过研究Postn对TGF-β/SMAD3信号通路和软骨退变的作用,为治疗OA提供一个新的视角和理论基础。三、材料和方法1、收集临床上OA患者和因车祸需进行截肢的患者的膝关节软骨各3例,通过RT-qPCR检测Postn在OA与对照组关节软骨面中转录水平的表达情况;利用C57/BL6小鼠构建DMM骨关节炎模型,通过western blot观察POSTN在OA发生后1、2、4、8周不同时间点的表达情况,并通过免疫组化观察POSTN在关节软骨面的定位及表达情况;2、利用ATDC5软骨前体细胞株进行体外实验,通过IL-1β刺激细胞株发生OA样改变,再利用siRNA沉默Postn基因,观察沉默Postn后对OA相关因子的表达情况;3、通过对DMM小鼠进行关节腔内注射慢病毒介导软骨细胞上Postn基因的沉默,检测其对OA形态结构学及生物功能学的变化情况;4、观察不同细胞因子对软骨细胞Postn基因的表达情况;并通过TGF-β 1细胞因子刺激ATDC5细胞,观察Postn在软骨细胞中是否受其调控并呈时间和浓度依赖性,并观察沉默Postn基因对TGF-β 1诱导的Co110a1和Mmp13在转录水平的表达情况;5、通过POSTN蛋白刺激及siRNA沉默Postn基因两种方法,观察SMAD3信号通路的表达水平以及软骨细胞基质酶MMP13的变化情况。6、通过SIS3通路抑制剂抑制SMAD3的磷酸化,观察POSTN蛋白是否通过SMAD3引起MMP13的表达。7、通过POSTN蛋白刺激软骨细胞观察SMAD3信号通路表面受体的活化程度。四、结果1、Postn在人及小鼠骨关节炎关节软骨中表达明显升高;2、体外实验通过沉默Postn基因后,Mmp13、Co110a、Runx2、Vegf的表达均不同程度的下降,而Co12表达明显升高,这提示沉默Postn基因能缓解IL-1β诱导的OA样改变,从而延缓软骨细胞退变;3、关节腔内注射慢病毒后,可见软骨细胞POSTN蛋白的表达明显下降,关节软骨磨损程度减轻,软骨厚度增加,MMP13表达减少,COL2表达升高,最后延缓DMM骨关节炎小鼠的发展进程;4、Postn在介导骨关节炎发展进程中受TGF-β细胞因子的调控,并呈时间和浓度依赖性,沉默Postn基因能阻断TGF-β诱导的Co110a1和Mmp13的表达上调;5、POSTN蛋白能促进SMAD3蛋白的磷酸化及上调MMP13的表达从而促进软骨退变;6、POSTN蛋白能活化SMAD3信号通路的细胞表面受体,主要表现为先活化Ⅱ型受体Acvr2b、Tgfbr2,随后募集并活化Ⅰ型受体ALK5、ALK7,从而把信息从细胞外传递至细胞内。五、.结论Postn在OA发病进程中表达上调;沉默Postn基因后通过减少基质酶的生成,抑制软骨细胞肥大和血管生成,促进Co12的合成,从而减少软骨细胞退变;关节软骨中沉默Postn基因能延缓OA的发展进程;Postn通过介导TGF-β/SMAD3信号通路引起软骨细胞基质酶MMP13的上调进而加重OA。本研究意义可为OA的研究提供新颖的实验依据,为OA的治疗提供新的药物靶点。