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研究背景子宫内膜癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一,是一组发生于子宫内膜的恶性上皮性肿瘤。近年来,在世界范围内,子宫内膜癌的发病率和病死率都有上升的趋势,甚至在一些发达国家,子宫内膜癌已排在严重危害女性健康的妇科恶性肿瘤的首位。现有的研究证实,子宫内膜癌的发生不仅与雌、孕激素水平有关,还与异常激活的原癌基因及肿瘤细胞增殖异常关系密切。一些致癌基因通过参与肿瘤细胞能量代谢的调节过程影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。近年来,随着对肿瘤分子生物学的不断深入研究,人们逐渐认识到能量代谢重编程在肿瘤发生发展中的重要作用。肿瘤的发生与发展是一个在物理因素、化学因素和生物因素作用下的多步骤过程。1924年,德国著名的生物化学家Otto Heinrich Warburg博士首次发现即便是在氧气充足的情况下,肿瘤细胞中糖酵解速率是正常细胞的两百余倍,肿瘤细胞主要通过糖酵解途径获得肿瘤细胞增殖所需的大量ATP。肿瘤细胞中糖酵解途径生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下生成乳酸,而不再进入三羧酸循环进行有氧氧化的现象被定义为瓦伯格效应（Warburg effect）。尽管Warburg效应的确切机制并不完全清楚,但有研究已经证实了一些与其密切相关的调控机制,例如糖代谢酶表达异常、线粒体氧化磷酸化损伤、抑癌基因失活、癌基因激活和肿瘤微环境的改变等。实验证实,这些能量代谢重编程的效应与肿瘤细胞的增殖和转移紧密联系。本实验中心早期在肿瘤组织中通过酵母双杂交实验筛选相互作用蛋白时得到候选基因ENKUR,本课题组建立稳定过表达ENKUR的子宫内膜癌细胞株,通过体外细胞功能实验及动物体内实验了解ENKUR基因在子宫内膜癌细胞中发挥的作用。我们通过CO-IP实验筛选外源性ENKUR的相互作用蛋白,发现涉及多个糖代谢通路上的蛋白,并进一步应用免疫荧光共定位、Western Blot等实验探索ENKUR基因发挥作用的机制。研究内容和方法1、在体外细胞水平研究ENKUR基因对子宫内膜癌的影响1)慢病毒感染高成瘤细胞,构建稳定过表达ENKUR的子宫内膜癌细胞株,并以空载病毒感染细胞做对照,Western Blot检测感染效率;2)MTT、EDU、平板克隆体外增殖实验检测过表达ENKUR后子宫内膜癌细胞增殖能力的变化;3)Transwell和Boyden细胞体外迁移侵袭实验检测过表达ENKUR后子宫内膜癌细胞侵袭转移能力的变化；2、在体内动物水平研究ENKUR基因对子宫内膜癌的影响1)应用裸鼠皮下成瘤模型,检测子宫内膜癌细胞过表达ENKUR后在动物体内成瘤能力的改变;2)通过裸鼠肝包膜转移模型检测ENKUR基因在动物体内对子宫内膜癌侵袭转移能力的影响;3、初步研究ENKUR基因介导的分子机制1)COIP实验筛选ENKUR基因对应蛋白ENKURIN的相互作用蛋白,免疫荧光共定位实验进一步在细胞内进行验证;2)Western Blot检测过表达ENKUR基因后子宫内膜癌细胞中糖代谢信号通路的变化;3)Western Blot检测过表达ENKUR基因后子宫内膜癌细胞中增殖、EMT相关信号通路的变化;4、PGK1和GRP78与子宫内膜癌患者临床病理特征及预后的关系1)收集30例正常子宫内膜组织标本及130例子宫内膜癌病理组织标本及患者临床信息;2)免疫组织化学法检测PGK1和GRP78在正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织中的表达情况;3)统计学分析PGK1、GRP78的表达情况与子宫内膜癌患者临床病理特征及预后的关系。结果1、在体外细胞水平研究ENKUR基因对子宫内膜癌的影响1)MTT、平板克隆、EDU实验证实,过表达ENKUR后子宫内膜癌细胞的增殖能力受到抑制;2)Transwell和Boyden实验证实,过表达ENKUR后子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭能力受到抑制;2、在体内动物水平研究ENKUR基因对子宫内膜癌的影响;1)裸鼠皮下成瘤实验表明,子宫内膜癌细胞过表达ENKUR后其增殖能力受到抑制;2)裸鼠肝包膜转移模型证实,过表达ENKUR后子宫内膜癌细胞的侵袭转移能力受到抑制。3、初步研究ENKUR基因介导的分子机制1)免疫共沉淀（COIP）实验筛选子宫内膜癌细胞中外源性ENKURIN蛋白的相互作用蛋白,质谱分析结果共得到754个蛋白,选取评分较高的蛋白,联合COIP和Western Blot进行验证,发现ENKUR与PGK1、GRP78存在相互作用。细胞免疫荧光实验进一步确认在子宫内膜癌细胞中ENKUR与PGK1、PGK1与GRP78存在共定位。2)Western Blot实验显示,稳定过表达ENKUR后,糖代谢相关蛋白LDHA、GRP78、β-catenin 下调,GLUT1、PGK1 差异不明显。3)Western Blot实验显示,稳定过表达ENKUR后,EMT相关蛋白E-cadherin 上调,N-cadherin、vimentin 下调,PI3K、p-PI3K、Akt、pAkt 下调,癌基因C-myc下调,凋亡相关因子ATM、Bim、caspase9、caspase3上调。4、PGK1和GRP78与子宫内膜癌患者临床病理特征及预后的关系1)相对于正常子宫内膜组织,PGK1和GRP78在子宫内膜癌组织中高表达;2)PGK1的表达在子宫内膜癌不同病理类型（P=0.007）,组织学分级（P=0.002）,FIGO分期（P<0.001）,淋巴结转移状态（P<0.001）中差异显著。GRP78的表达在子宫内膜癌不同组织学分级（P=0.019）,FIGO分期（P<0.001）,淋巴结转移状态（P<0.001）中差异显著。3)生存曲线分析显示,PGK1和GRP78高表达患者的生存时间少于低表达患者（P<0.001）。结论子宫内膜癌细胞株稳定过表达ENKUR后,通过一系列体外细胞功能实验及动物体内实验,证实肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移能力减弱。COIP实验筛选外源性ENKUR的相互作用蛋白,结合免疫荧光共定位和Western Blot的结果,我们推测ENKUR可能通过与PGK1、GRP78相互作用,并直接下调GRP78,抑制糖代谢,从而促进细胞凋亡,抑制子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和转移。