由于生物学反应的复杂性,传统的体相检测技术可以检测到反应过程的总体变化,但很难对生物反应的分子过程和瞬时状态进行直观的检测。近些年来兴起并逐渐成熟的单分子技术包括单分子荧光共振能量转移、磁镊等提高了人们实时研究生物大分子行为和机理的能力;本文利用体相和单分子荧光技术研究蛋白质和DNA相互作用过程和机制,我们可以全面地了解到生物反应的过程,极大地增强了人们理解复杂生命过程的能力。含有铁-硫团簇大肠杆菌的Din G蛋白(Ec Din G)能够使Cy3荧光染料发生淬灭,但具体机理不太清楚。通过加入氧化剂过氧化氢、还原剂DTT探究铁-硫团簇和Cy3之间可能发生的电子转移,证明了Cy3淬灭可作为研究解旋酶与DNA具体运动的特异性和灵敏探针。核酸是遗传信息的载体,由脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)组成,已知所有生物体的生命活动都离不开核酸的转录、复制、翻译等一系列反应,而这其中需要解旋酶打开核酸间的氢键。一旦解旋过程出现问题,生物体将出现疾病而不能正常生存,因此研究和理解解旋酶解旋不同核酸结构的解旋行为和潜在的机制尤为重要。细胞在受到外部条件干扰时,核酸结构很容易遭到破坏。耐辐射奇球菌具有很强抵抗DNA破坏作用的能力,已被用作研究DNA修复机制的模型。它没有对于细菌双链DNA断裂修复来说必不可少的Rec BCD(解旋酶)或Add AB(核酸酶),但它却有Rec BCD解旋酶单元Rec D的同源物DrRecD2。DrRecD2解旋酶作为研究超家族1B(SF1B)解旋酶的结构模型,在耐辐射奇球菌的DNA链断裂修复中起着重要作用,但是DrRecD2解旋双链DNA具体行为和机制仍然是未知的。在生物体中虽然双链DNA占比很大,但DNA可以变形成其他结构。G4-四链体DNA就是耐辐射奇球菌基因组中常见的二级结构,在细胞的生命活动中发挥着重要作用,但有时G4结构能够成为DNA复制机制的障碍,需要解开G4结构DNA,细胞才能完成正常的生理活动。不幸的是,耐辐射奇球菌中的G4的解旋酶尚未得到很好的鉴定,因此研究DrRecD2解旋G4-四链体DNA的解旋机制,对于复制过程中保持基因组完整性和稳定性是非常重要的。本研究首先将铁-硫团簇蛋白与不同链长的Cy3标记的单链DNA作用并加入过氧化氢和DTT,通过Cy3荧光强度和体相寿命的测量可以知道:DNA链长越短,Cy3荧光淬灭的越严重;铁-硫团簇与Cy3的反应过程中,Cy3把电子转移给铁-硫团簇。接着通过单分子技术水平上的操作(全内反射荧光显微镜和磁镊)对DrRecD2解旋酶解旋双链和G4-四链体DNA的作用机理进行探究。通过把荧光染料Cy3和Cy5标记在不同链长的单链DNA、G4结构DNA上,然后把互补的单链放在PCR仪上加热、冷却进行退火重组,DNA单链通过氢键连接成双链。在荧光共振能量转移实验中,用链霉亲和素把生物素化修饰的DNA连接在PEG化处理的玻璃反应小室中,随后分别加入不同浓度的DrRecD2解旋酶、ATP(提供能量)、寻找DNA焦平面进行数据采集分析。用单分子全内反射显微镜系统、磁镊等工具来反映发生荧光共振能量过程中供体Cy3和受体Cy5荧光强度的变化,推断供体Cy3和受体Cy5距离的大小变化来得到DNA内部结构改变。通过研究可以得到以下结论:(1)DrRecD2解旋较短链长的双链DNA(含有17个碱基对)呈现一步解旋现象。(2)DrRecD2解旋较长链长的双链DNA(含有29个碱基对),相比17个碱基对的DNA,解旋比例和速度明显降低并且出现重复解旋现象。重复解旋现象是由单个解旋酶分子完成的,而不是多个解旋酶单体一块完成。(3)DrRecD2解旋较长双链DNA的模型为:当DrRecD2达到解旋极限时,会通过链切换到达互补的单链DNA上,然后向后移位,最后切换并重新抓住初始链。(4)DrRecD2解旋极限受ATP浓度的影响,ATP浓度越高,DrRecD2解旋双链DNA的长度越长。(5)DrRecD2解旋G4-四链体DNA影响其解旋双链部分,G4结构阻碍DrRecD2的解旋。DrRecD2可以解旋平行和反平行的G4结构DNA,并且没有明显的拓扑偏好;而Sc Pif1解旋反平行G4结构DNA能力更强。因此,本研究提供了DrRecD2解旋酶一种新的功能信息,并且可能有助于理解超家族1B(SF1B)解旋酶的解旋DNA结构的机制和能力。