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狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的急性传染病，在世界范围内广泛分布，目前尚未得到完全控制，面临着非常严峻的防制形势。RV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus)，基因组由11928—11932个核苷酸组成，为单股、不分节段的负链RNA，编码核蛋白(N蛋白)、磷酸蛋白(P蛋白)、基质蛋白(M蛋白)、糖蛋白(G蛋白)、RNA聚合酶(L蛋白)五种结构蛋白。N蛋白是RV最保守的蛋白，可激发机体产生抗病毒核衣壳抗体，因此可作为血清学特异诊断的抗原；G蛋白是唯一能刺激机体产生中和抗体的病毒蛋白，其抗原表位集中在膜外区部分，且G蛋白膜外区保守性高，因此利用重组DNA技术制备G蛋白膜外区抗原是监测RV抗体另一种有效的选择。本实验以RV ERA毒株为模板，经RT—PCR成功克隆了N蛋白基因和G蛋白基因，并构建了N蛋白基因和G蛋白基因的多种原核表达载体，通过优化表达条件，在体外高效表达了RVN蛋白和G蛋白膜外区，获得纯化的N蛋白和G蛋白，为进一步狂犬病诊断方法的建立奠定了基础。具体结果如下：
1.根据已登录的RV ERA株N蛋白基因序列(GenBank Acc.NoAF406695)设计合成特异性引物，经RT—PCR从RV ERA株中扩增了编码N蛋白基因，将其克隆于原核表达载体pET—28a(+)和pET—32a(+)中，成功构建融合重组质粒pET28a—NP和oET32a—NP。经SDS—PAGE电泳和Western blot分析表明，N蛋白基因编码产物均可在E. coli中成功表达，其分子量分别为53kDa和70kDa，并可被兔抗RV多抗特异识别，表明N蛋白具有良好的反应原性。通过不同表达载体的比较和表达条件优化，N蛋白获得高效表达，在两种不同的表达系统中，N蛋白在pET—32a(+)中的表达量(29.3％)高于在pET=28a(+)的表达量(17.9％)。
2.N蛋白NP/pET28a和NP/pET32a超声波裂解后经SDS—PAGE电泳分析，这两种重组蛋白在E.coli中均以包涵体形式存在。在蛋白纯化前用PBS悬浮N蛋白菌体沉淀，超声波裂解后离心，用3mol/L尿素溶液洗涤沉淀，大部分杂蛋白以可溶的形式存在于裂解上清中，N蛋白仍然以包涵体的形式存在，N蛋白占菌体沉淀的90％。再经Ni—NTA亲和层析纯化，获得高纯度的N蛋白NP/pET28a和NP/pET32a，产量分别为8.45mg/L和13.6mg/L，表明pET—32a(+)系统表达的N蛋白纯化得率高于pET—28a(+)。
3.根据已登录的RV ERA株G蛋白基因序列(GenBank Acc.NoAF406693)设计合成特异性引物，经PCR扩增出G蛋白膜外区基因，分别克隆于原核表达载体pET—28a(+)和pET—32a(+)中，成功构建融合表达重组质粒pET28a—GP和pET32a—GP以及非融合表达重组质粒pET28a—GPF，经SDS—PAGE电泳和Western blot分析表明，G蛋白膜外区基因编码产物均可在E.coli中成功表达，其分子量分别为52kDa、69kDa和50kDa，并可被兔抗RV多抗特异识别，表明G蛋白膜外区抗原保留了G蛋白良好的反应原性。通过表达载体筛选和表达条件优化，G蛋白膜外区在pET28a(+)中的表达量以融合形式(38.7％)高于非融合表达形式(20.9％)；在不同表达载体中，RV G蛋白膜外区在pET—32a(+)中的表达量(45.4％)高于在pET—28a(+)的表达量(38.7％)。4.RV G蛋白GP/pET28a、GP/pET32a和GPF/pET28a经超声波裂解后经SDS—PAGE电泳分析，在E.coli中均以包涵体形式存在。在蛋白纯化前用PBS悬浮G蛋白菌体沉淀，超声波裂解后离心，用3mol/L尿素溶液洗涤沉淀，大部分杂蛋白以可溶的形式存在于裂解上清中，G蛋白仍然以包涵体的形式存在，G蛋白占菌体沉淀的90％。再经Ni—NTA亲和层析纯化，获得高纯度的G蛋白GP/pET28a、GP/pET32a和GPF/pET28a，产量分别为15.48mg/L、20.4mg/L和8.75mg/L，表明pET—32a(+)系统表达的融合G蛋白纯化得率高于pET—28a(+)表达的融合G蛋白，而在pET—32a(+)系统中，融合G蛋白纯化得率高于非融合G蛋白。