论文部分内容阅读
[目的]癌症作为严重威胁人类健康的疾病之一,不仅对患者身心造成了危害,而且还给家庭、社会和国家带来了巨大的经济负担。目前临床上恶性肿瘤的常见治疗手段包括手术、放化疗以及靶向治疗等,但这类治疗不能有效的控制一些恶性肿瘤的进展及复发,也不能有效的延长此类患者的生存期及改善患者的生存质量。因此迫切需要寻求新的治疗手段。近年来免疫治疗成为一种重要的肿瘤治疗手段,给攻克恶性肿瘤带来了希望。研究表明大多数的肿瘤细胞能够躲避免疫系统的识别,从而限制免疫治疗的抗癌效果。嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T,CAR-T）细胞治疗技术具有良好的靶向性、杀伤性、增殖性及持久性而成为肿瘤免疫治疗的热点。虽然大量的临床研究证实该技术在改善血液恶性肿瘤患者生存质量及延长患者生存期方面取得了巨大的成功。然而该技术在实体肿瘤的研究还不够成熟,未能达到期待的治疗效果,仍然面临许多挑战,包括:实体瘤组织特殊的病理学特征,肿瘤周围免疫抑制微环境、共刺激分子的优化组合、自杀基因的设计、回输后的不良反应等。本研究目的为探索通过piggyBac转座子系统构建靶向间皮素（mesothelin,MSLN）的MSLN-CAR-T细胞对实体肿瘤的靶向杀伤性,及该培养体系下的MSLN-CAR-T细胞的杀瘤活性及安全性,为该治疗方法的临床转化提供研究基础。[方法]本研究中涉及的动物实验经过昆明医科大学附属延安医院动物伦理委员会批准。一、Mesothelin嵌合抗原受体修饰T细胞体外靶向杀伤恶性肿瘤的功能验证通过Western blot筛选出mesothelin高表达的肿瘤细胞,同时对于mesothelin低表达的肿瘤细胞通过慢病毒的转染使其人工过表达mesothelin。通过piggyBac转座子系统转染T细胞,获得第三代MSLN-CAR-T细胞,并用空载质粒作为对照control T细胞,利用流式细胞术检测CAR在T细胞中的表达,检测其转染效率。通过不同的方式检测MSLN-CAR-T细胞对mesothelin高表达的细胞株及低表达细胞株的杀伤作用。进一步通过ELISA检测MSLN-CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后细胞因子的分泌情况。二、Mesothelin嵌合抗原受体修饰T细胞体内靶向杀伤恶性肿瘤的功能验证选用天然表达mesothelin抗原的BGC-823细胞株和SPC-A-1细胞株、不表达mesothelin抗原的MDA-MB-231细胞株及mesothelin抗原人工过表达的MDA-MB-23 MSLN（OE）细胞株作为构建mesothelin裸鼠荷瘤模型所用的肿瘤细胞,并用Nude裸鼠作为构建裸鼠模型所用的裸鼠品系,构建人间皮素荷瘤裸鼠模型。在成功构建间皮素荷瘤裸鼠模型,向模型裸鼠体内注射新培养制备的control T或者MSLN-CAR-T细胞,并通过测量肿瘤体积的大小、肿瘤体重的变化,比较control T或者MSLN-CAR-T细胞在裸鼠体内的杀瘤活性。三、Mesothelin嵌合抗原受体修饰T细胞靶向恶性肿瘤的体内浸润性及安全性研究观察注射control T或者MSLN-CAR-T细胞的荷瘤裸鼠的生存状态和体重变化,并在适当时间处死裸鼠后观察裸鼠各个脏器的病理切片是否出现器质性病变从而判断裸鼠是否发生不良反应及处死裸鼠后检测MSLN-CAR-T细胞对肿瘤组织的浸润、抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡等相关指标的免疫荧光以反应MSLN-CAR-T对肿瘤组织的浸润、抑制增殖、诱导凋亡的能力。[结果]一、Mesothelin嵌合抗原受体修饰T细胞体外靶向杀伤恶性肿瘤的功能验证:通过Western blot我们筛选出mesothelin高表达和低表达的肿瘤细胞,其中,mesothelin在胃腺癌细胞BGC-823和肺腺癌细胞SPC-A-1高表达,而在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和前列腺癌细胞LNCaP低表达;同时成功通过慢病毒的转染对低表达的肿瘤细胞MDA-MB-231和LNCaP进行mesothelin的过表达,并通过piggyBac转座子系统及流式细胞术检测,成功构建出约20%阳性率的MSLN-CAR-T 细胞。通过将MSLN-CAR-T细胞与肿瘤细胞进行共培养,结果显示control T细胞对肿瘤细胞株均没有杀伤作用。MSLN-CAR-T细胞对mesothelin高表达的细胞株的杀伤作用明显强于低表达的细胞株,且随着效靶比的增加杀瘤能力更加明显;通过ELISA检测MSLN-CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养的上清,发现MSLN-CAR-T细胞与mesothelin过表达的细胞株共培养后,IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、Perforin及Granzyme B的分泌量相比mesothelin不表达的细胞株明显升高且随着效靶比的增加而增加;收集共培养后的肿瘤细胞,通过Western blot检测发现,与MSLN-CAR-T细胞共培养后的肿瘤细胞凋亡相关蛋白Bax和Bad的表达以及Cleaved-Caspase-3与Caspase-3的比例相对对照组升高。二、Mesothelin嵌合抗原受体修饰T细胞体内靶向杀伤恶性肿瘤的功能验证:成功构建裸鼠肿瘤模型1周后向裸鼠尾静脉注射MSLN-CAR-T细胞,研究发现MSLN-CAR-T细胞治疗组较空白对照组及control T组肿瘤体积及体重均更小,表明MSLN-CAR-T细胞在裸鼠体内能一定程度抑制肿瘤生长,使裸鼠体重变化更趋于稳定,同时显著延长了裸鼠生存时间。三、Mesothelin嵌合抗原受体修饰T细胞靶向恶性肿瘤的体内浸润性及安全性研究:注射MSLN-CAR-T细胞治疗的裸鼠未发现明显的不良反应,病理切片中各重要组织脏器未见明显器质性病变。肿瘤相关的增殖、凋亡及肿瘤内浸润的MSLN-CAR-T免疫荧光标记检测发现,注射MSLN-CAR-T细胞治疗的裸鼠,MSLN-CAR-T细胞的浸润性更好,肿瘤细胞的增殖明显被抑制,肿瘤细胞凋亡明显增多,表明MSLN-CAR-T细胞具有良好的抗肿瘤特性。[结论]一、本实验piggyBac转座子可成功构建MSLN-CAR-T细胞。二、本实验构建的MSLN-CAR-T对mesothelin高表达的恶性肿瘤细胞株具有更强的杀伤活性及靶向性。三、MSLN-CAR-T细胞可较好的抑制动物体内实体肿瘤进展、延长动物生存时间及具有良好的体内治疗安全性。