论文部分内容阅读
研究背景骨髓增殖性肿瘤（Myeloproliferative neoplasma,MPN）是一类造血干细胞克隆性疾病,是一类以一系或多系细胞持续异常增殖为特征的血液系统疾病,常见的MPN包括慢性粒细胞性白血病、真性红细胞增多症（Polycythel1lia vera,PV）、原发性血小板增多症（Essential thmmbocvthemia,ET）、原发性骨髓纤维化;较少见的MPN包括慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸粒细胞白血病、系统性肥大细胞增多症及其他未分类疾病（骨髓增殖特性的一些骨髓恶性肿瘤,如慢性骨髓系白血病和非典型慢性髓细胞性白血病）。患者临床表现为髓外造血（可导致脾肿大）、贫血、白细胞异常增多、骨髓纤维变性等症状,在病理后期可转化为急性白血病。目前临床针对MPN尚无有效的治疗手段,对患者主要采用支持疗法,目的是降低过高的白细胞数或脾大,但并不能延长患者寿命,也难以有效改善其全身症状。所以积极探讨骨髓增殖性肿瘤包括白血病等难治性血液系统疾病的发病机制并寻找有效的治疗靶点仍然是我们亟待解决的难题。蛋白质酪氨酸磷酸酶2（SHP2）是一种由Ptpn11基因编码的一种非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶,参与多种信号通路转导过程的激活,已经被证实在多种癌症的发生发展过程中起到关键性作用;并且SHP2蛋白多见于各种造血细胞中,在造血细胞的生长发育、增殖分化过程中起着十分重要的作用。SHP2蛋白的突变被认为是白血病,尤其是青少年粒单细胞白血病（Juvenile myelomonocytic leukemia,JMML）,儿童骨髓增殖性肿瘤（Juvenile myeloproliferative neoplasm,MPN）的高危因素,因其在多种类型白血病中均存在着异常突变和活化的现象,因此也被认为可能是白血病的原癌基因。氨基酸转运载体2（Amino-acid Transporter 2,ASCT2）是一种由Slc1a5基因编码的中性氨基酸载体,主要转运谷氨酰胺、丝氨酸、丙氨酸和半胱氨酸等,其中经由其转运进入细胞内的谷氨酰胺不仅作为反应底物参与细胞内的三羧酸循环,为细胞生长提供能量,同时其降解产物还能为细胞提供生命合成必要的氮源,对处于快速增殖状态的癌细胞起着至关重要的作用。ASCT2的高表达已被证实在诸如三阴性乳腺癌,子宫内膜癌等多种癌症的发生发展过程中起到关键作用,抑制ASCT2的表达则可有效的抑制癌细胞的恶性增殖。虽然目前科学界对谷氨酰胺载体ASCT2的生理学功能进行了大量的研究,然而,病理情况下,尤其是在血液系统肿瘤中的调控作用,研究不多。而有关ASCT2在SHP2激活突变后的疾病发病机制中的作用至今未见报道,因此,本研究拟采用SHP2激活突变的小鼠模型,探索ASCT2蛋白对SHP2激活突变后致骨髓增殖性肿瘤及白血病的影响,并且使用ASCT2抑制剂（GPNA）观察其能否抑制骨髓增殖性肿瘤及白血病的发病进程。研究方法1.选用C57BL/6J（Mx1-Cre+）小鼠和C57BL/6J(Ptpn11E76K)小鼠配繁,构建Ptpn11E76K/+/Mx1-Cre+激活突变鼠。2.通过流式细胞技术分离正常小鼠和突变鼠HSCs和MSCs,并体外培养。3.通过Western-Blot技术对比分析ASCT2和p-m TOR、、p-ERK、p-AKT、p-S6等细胞增殖和能量代谢相关蛋白的表达。4.检测两组小鼠细胞和血清中谷氨酰胺和支链氨基酸的含量。5.通过腹腔注射ASCT2抑制剂（GPNA）构建ASCT2低表达的突变鼠模型。6.通过Western-Blot等技术分析比较突变鼠和药物处理组ASCT2表达、细胞增殖和能量代谢相关指标的变化。实验研究结果1.成功构建Ptpn11E76K/+/Mx1-Cre+激活突变鼠MPN模型。2.突变鼠比正常小鼠的ASCT2表达增高,突变鼠间充质干细胞增殖能力增强p-m TOR、p-ERK、p-AKT、p-S6等细胞信号分子表达增强。3.突变鼠骨髓间充质干细胞及血清中谷氨酸盐含量明显较高。4.ASCT2抑制剂处理Ptpn11E76K/+/Mx1-Cre+突变鼠后,小鼠脾脏较未处理组缩小,骨髓细胞谷氨酸含量明显较低,AKT/m TOR信号通路活性被抑制,显示抑制ASCT2后,骨髓增殖性肿瘤及白血病的发病进展受阻。结论ASCT2的表达量与SHP2激活突变后致骨髓增殖性肿瘤及白血病的发病进程息息相关,抑制ASCT2活化后能够降低MPN和白血病细胞对谷氨酰胺的摄取能力,有效的抑制SHP2突变型骨髓增殖性肿瘤及白血病的发病进程。显示ASCT2可能是治疗该类型疾病的有效靶点。