基于体细胞胚胎发生的甜瓜转基因体系构建

来源 :浙江大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lbc573332496
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转基因技术是植物基因功能研究的最有效技术之一,也是未来作物精准育种的候选途径。但是由于再生体系不成熟等因素,转基因技术在大多数蔬菜作物中应用还存在障碍。甜瓜是我国乃至全世界的重要蔬菜作物。传统的甜瓜转基因体系存在着再生效率低、嵌合体概率高等缺陷。本研究从建立高效甜瓜体细胞胚途径再生体系入手,研究了以不同基因型甜瓜种子切块为外植体,诱导愈伤组织从而萌发胚胎,最后再生为完整植株的再生体系。并在此基础上,建立了基于农杆菌介导的甜瓜转基因技术体系。取得主要成果如下:1、建立了基于体细胞胚胎发生的甜瓜再生体系:通过筛选激素种类和激素浓度配比,以及对十二种甜瓜基因型进行体胚的诱导,发现粗皮甜瓜材料’Vedrantais’在激素组合2,4-D和6-BA中诱导体胚效率最高,其余几种基因型甜瓜能够诱导愈伤组织形成,且愈伤组织不断膨大,但是体细胞胚产生概率极低。此外,诱导体细胞胚形成最佳培养基配方(1L)为:MS + 30g蔗糖+ 2 mg/L 2,4-D+ 0.1mg/L6-BA,液体培养7-8周,再生固体培养基:MS + 30g蔗糖;生根培养基配方:MS+15g蔗糖。2、利用二元质粒法构建了基于pBBRacdS的超级农杆菌:为提高根癌农杆菌介导的甜瓜转化效率,导入pBBRacdS质粒载体,实现在农杆菌工程菌中表现ACC脱氨酶活性,可降低农杆菌侵染后外植体或愈伤组织细胞中乙烯含量,提高再生效率。此后,通过二元质粒法将目标基因CmWRKY27过表达载体经历两次电转导入含有pBBRacdS的根癌农杆菌,对甜瓜进行侵染。3、获得了甜瓜转基因植株:将种子切块预培养两天,用含双载体的农杆菌菌液进行侵染后共培养,液体选择培养基:EI液体培养基+5mg/LHygromycin+ 25 mg/L Timentin;固体选择培养基:MS + 30g 蔗糖 +15 mg/L Hygromycin +100mg/LTimentin。结果显示,转化体系的转化率为0.18%。该体系筛选效率高,有效节省后续鉴定工作量。本实验建立了基于体细胞胚途径的甜瓜再生及转基因体系,提高再生效率并降低嵌合体概率。有助于甜瓜的功能基因研究,为将来的甜瓜分子设计育种提供重要技术储备,并为其他葫芦科作物提供借鉴。
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