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目的:HBV不能在体外培养,其感染宿主范围窄,动物模型缺乏,制约了HBV研究方法的进展。将携带HBV基因的质粒转染入靶细胞,建立表达HBV相关蛋白的体外细胞模型对研究HBV相关疾病的发病机制及各基因产物的生物学功能有很大帮助。我们采用PCR方法分别扩增HBV的四种抗原基因片段,通过中间载体pEASY-T1 Simple,构建包含四种抗原基因的重组真核表达质粒,并转染肝母细胞瘤细胞HepG2,同时转染正常肝细胞LO2作为对照,监测抗原的表达,为研究各抗原的生物学功能及其与免疫细胞的相互作用奠定了实验基础。方法:⒈包含HBV的各抗原基因片段的重组质粒的构建(1)采用PCR方法分别扩增HBV的各抗原基因片段(2)通过中间载体pEASY-T1 Simple,构建分别包含四种抗原HBsAg,HBeAg,HBcAg,HBeAg(P22)基因的重组真核表达质粒。(3)重组质粒的双酶切,DNA测序鉴定。2、瞬时转染细胞模型的建立:(1)转染方法:采用脂质体转染法将各重组质粒转染入肝母细胞瘤细胞HepG2,同时转染正常肝细胞LO2作为对照,建立表达HBV抗原基因的体外真核细胞模型。根据转染质粒的不同,将HepG2细胞分为三组:转染组(转染各重组质粒),对照组(转染空质粒),空白组(未转染重组质粒),每组设三个复孔。(2)转染效率的监测重组质粒与含有EGFP标记基因的质粒pEGFP-C1共转染HepG2细胞后24,48,72h,荧光显微镜下观察HepG2细胞GFP的表达情况,并计算转染效率。(3)转染细胞各抗原基因的表达分析:1)Western blot及免疫荧光检测各组细胞中相关抗原的表达水平:热泼法收集转染各重组质粒的HepG2细胞转染后48,72h细胞总蛋白,收集转染空质粒的HepG2细胞转染后48h总蛋白,及正常培养48h的HepG2细胞总蛋白,Western blot分析各组细胞相应抗原的表达水平;取转染各重组质粒48h的HepG2细胞,转染空质粒48h的HepG2细胞,正常培养48h的HepG2细胞,免疫荧光法分析各组细胞相应抗原的表达。2)电化学发光法定量检测各组细胞相应抗原表达的水平收集转染各重组质粒24,48,72h的HepG2细胞培养上清,转染空质粒48h的HepG2细胞上清,正常培养48h的HepG2细胞上清,10,000rpm离心5min使细胞沉淀于管底,取上清液经电化学发光法定量检测各组细胞相应抗原的表达。每个实验均重复三次。结果:1、重组质粒的构建:成功扩增出HBV各抗原基因片段,并得到含四种抗原基因的重组真核表达质粒pCMV-tag2B-HBs,pCMV-tag2B-HBe, pCMV-tag2B-HBc,pCMV-tag2B- HBeAg(P22),重组质粒经双酶切,DNA测序鉴定正确。2、表达HBV抗原基因的体外真核细胞模型建立:(1)转染效率重组质粒与含有EGFP标记基因的质粒pEGFP-C1共转染后,可见HepG2细胞有大量明亮的绿色荧光蛋白(GFP)表达,转染效率高。且转染后不同时间,转染效率无明显差异,可做后续实验。(2)转染后不同时间HepG2细胞相应抗原蛋白表达的水平WB结果显示转染各重组质粒的HepG2细胞于转染后48及72h均可表达相应HBV抗原,相对表达量提示转染后不同时间点目的蛋白的表达量没有明显差异,P>0.05。免疫荧光结果显示抗原蛋白主要分布于胞浆中,胞核胞膜中仅有少量分布;空白组及转染了空载体的阴性对照组HepG2细胞不能表达抗原蛋白,与Western blot结果一致。上述真核表达质粒转染LO2细胞后48 h也有相应抗原的表达,说明构建的真核表达质粒携带的外源基因可在体外培养细胞中正确表达。(3)转染组(转染各重组质粒)HepG2细胞转染后不同时间上清中相应抗原表达的水平用电化学发光法定量检测转染组细胞上清中HBsAg,HBeAg的水平,发现pCMV-tag2B-HBs,pCMV-tag2B-HBe转染HepG2细胞后24h上清中可检测到HBsAg,HBeAg的存在,且转染后48h水平显著高于转染后24,72h的水平,P﹥0.05,但72h上清中HBeAg已检测不到;pCMV-tag2B-HBeAg(P22)转染HepG2细胞后仅48h上清中可检测到HBeAg的存在,转染后24,72h HBeAg检测不到。结论:1、以脂质体为载体介导重组质粒pCMV-tag2B-HBs,pCMV-tag2B- HBe, pCMV-tag2B-HBc,pCMV-tag2B-HBeAg(P22)转染人HepG2细胞株,转染效率较高。2、重组质粒携带的外源基因可在体外培养细胞中正确表达,且转染后不同时间细胞中目的蛋白表达量未见明显差异。3、重组质粒转染细胞后不同时间,细胞培养上清中分泌性蛋白的表达量有显著差异。