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近年来,病毒介导的基因治疗受到广泛关注。与其他病毒相比,腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)因具备安全性好、宿主范围广、免疫原性低和表达稳定等优点,被广泛应用于基因治疗研究。为了满足临床研究及基因治疗对高纯度、高质量AAV的需求,需要建立一种简单、高效的AAV纯化方法。目前,AAV从裂解的包装细胞中获得,需额外进行细胞裂解、去除细胞碎片及宿主细胞DNA和蛋白质等过程,常常需要结合多种方法进行纯化,操作繁琐,耗时耗力。为了获得更大量的增强型绿色荧光蛋白-腺相关病毒血清型9(Enhanced green fluorescent protein adeno-associated virus 9EGFP-AAV9),本文首先通过优化“包装质粒与聚乙烯亚胺(PEI)质量比”和“三包装质粒摩尔比”来找到产生大量EGFP-AAV9的最佳三质粒和转染试剂用量;然后利用AAV9血清型在转染后可以大量释放入培养基中的特性,采用“七天内隔天收集EGFP-AAV9”的方法,以期获得最大EGFP-AAV9产量。随后选择切向流过滤(TFF)和聚乙二醇(PEG)8000沉淀法,对EGFP-AAV9进行浓缩纯化,并通过SDS-PAGE、q PCR,以及体外感染人肾上皮细胞系(293T细胞)比较两种方法对EGFP-AAV9纯度、滴度及细胞转导效率等生物学特性的影响。为了获得更高的纯度,将EGFP-AAV9分别进行碘克沙醇超速离心及超滤离心管(100k Da)进行脱盐、浓缩,比较了两种方法纯化EGFP-AAV9的操作过程、消耗时长,并以上述同样的方法检测了二者对EGFP-AAV9生物学特性的影响。最后,通过感染293T细胞,提取基因组DNA、总RNA和总蛋白样品分别进行PCR、RT-PCR和免疫印迹(WB)检测,评估EGFP体外表达情况。此外,应用EGFP-AAV9感染鸡成纤维细胞系(DF-1)和鸡淋巴瘤细胞(DT40),检测其转导效率。结果显示:(1)当“质粒与PEI质量比”以及“三包装质粒(p AAV-CAG-GFP、p Helper、p AAV-RC9)摩尔比”分别为1:3和2:1:1时,AAV-293细胞转染效率最高,以此比例可产生最大产量EGFP-AAV9;(2)TFF-Iodixanol和PEG8000-Iodixanol两种纯化方法耗时大致相等,但前者获得的EGFP-AAV9具有更高的滴度及293T细胞体外感染效率;(3)提高EGFP-AAV9纯度能明显改善对293T细胞转导效率;(4)PCR、RT-PCR和WB均证实,EGFP在293T细胞中成功表达;(5)EGFP-AAV9对鸡DF-1和DT40细胞感染效率极低,表明其可能不适合于禽类细胞的体外感染。结论:本研究获得了产生大量EGFP-AAV9的最佳三质粒及PEI用量;TFF-Iodixanol法纯化EGFP-AAV9效果最佳,其纯化的EGFP-AAV9可获得更高的293T细胞感染效率;EGFP-AAV9对鸡DF-1和DT40细胞的感染效率极低。