研究背景脓毒症主要是指宿主/机体对感染的反应失调而引起的一种常见临床综合征,可继发于重大创伤、手术、烧伤、严重感染等临床重症,发病率、死亡率居高不下。即使有着现代新的抗生素和新的治疗手段,并发脓毒症休克和机体多器官功能障碍(MODS,Multiple organ dysfunction syndrome)的致死率仍然在50%以上。脓毒症病因和发病机制复杂,往往涉及多个脏器和器官。目前,机体失控性炎症学说,被认为是脓毒症病理生理机制的重要基础,因此炎症反应平衡失调一直是脓毒症发生发展机制的研究重点。创伤作为最为严重的全球性公共健康问题之一,给全球疾病造成的总负担占10%。创伤引起的抗炎和促炎平衡的失调,一方面会引起器官脏器的实质性损伤,另一方面会增加脓毒症及其相关并发症的发生率。因此有效防治脓毒症和MODS等相关并发症,是提高创伤救治水平的关键。但目前脓毒症仍未发现特效药物或明确治疗方式,因此脓毒症的早期预警和诊断显得尤为重要,尤其是创伤后,这使得相关潜在生物标志物的探究一直是研究的热点。迄今为止,常见的C反应蛋白(C-reactive protein,CRP),降钙素原(Procalcitonin,PCT)和白介素(Interleukin,IL)虽然已经用于脓毒症的诊断,但在具体判断中各有优缺点。近年来,越来越多研究者关注在先天免疫与凋亡等各大生物过程中发挥重要作用的非编码RNA。已有研究发现lnc RNA与某些复杂疾病(如脓毒症,代谢紊乱,癌症和心血管疾病等)密切相关。在脓毒症方面,已证实lnc RNA NEAT1(后称:NEAT1)在脓毒症患者血清中的表达量显著高于健康人群,提示NEAT1有可能作为脓毒症的潜在生物标志物,并在脓毒症病理生理过程中对炎症反应程度发挥调控作用。另外,作为当前基因表达调控的研究热点,lnc RNA可作为竞争性内源RNA,靶向与特定的mi RNA结合,从而抑制mi RNA的表达。同时,mi RNA本身由于其疾病特异性,相对稳定性和易于获取性等特征,具有成为某些特定疾病诊断与预后的潜在生物标志物的基础。本研究通过ENCORI在线软件提供了许多可能由NEAT1发挥海绵作用的mi RNA,其中一部分是和炎症相关:mi R495-3p和mi R-211。因此提出mi R495-3p和mi R-211可能在脓毒症引起的炎症反应的调控中发挥作用,但NEAT1、mi R495-3p和mi R-211是否是脓毒症乃至创伤相关炎症的主要参与者,仍需要详细的探究和验证。研究目的本研究旨在从炎症的角度解释lnc RNA NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211与脓毒症/创伤的关联。通过构建创伤和脓毒症相关小鼠模型,观察其生存情况和促炎因子的表达并分析和NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211的相关性。进一步通过炎症细胞模型探究NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211在炎症反应中的调控机制,阐明NEAT1,mi R-495-3p,mi R-211和相关信号轴的作用机制,为脓毒症和创伤的诊治提供新的可能。研究方法第一部分NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211基因表达水平对脓毒症/创伤小鼠模型生存状况、促炎因子表达水平的影响通过构建假手术组(SHAM)、脓毒症组(LPS)、创伤组(TH)、创伤+脓毒症组(TH+LPS)的小鼠模型,跟踪记录小鼠的生存情况,绘制生存曲线。同时收集小鼠的血清、肝、脾和肺组织,使用自动生化分析仪定量分析小鼠肝功能,酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定小鼠血清和肝组织中的相关炎性细胞因子,MTT法评估脾细胞的增殖情况,并提取小鼠肺组织的RNA,使用RT-PCR检测NEAT1、mi R-495-3p和mi R-211的表达和分析其和小鼠生存率的相关性。最后采用生信分析的方法,将上述实验结果输入R软件,生成相关矩阵。第二部分NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211在炎症细胞模型中的作用通过LPS构建单核巨噬细胞的炎症反应模型,通过蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞中炎症相关因子(p-PI3K,PI3K,p-AKT,AKT,TNF-α,IL-8,IL-10和MCP-1)的表达水平,使用RT-PCR检测NEAT1、mi R-495-3p和mi R-211的表达情况。为了进一步验证基因的相关关系,依托细胞转瞬的技术用质粒转染靶基因并且通过荧光素酶报告基因分析NEAT1和mi R-495-3p/mi R-211的靶向调控关系。第三部分NEAT1对mi R-495-3p和mi R-211相关信号轴的调控作用在RAW264.7单核巨噬细胞中,采用Western blotting技术检测NEAT1、mi R-495-3p、STAT3过表达情况下STAT3蛋白的表达量,使用RT-PCR技术检测,在STAT3过表达情况下,NEAT1和mi R-495-3p基因的表达量,并采用荧光素酶报告基因技术检测mi R-495-3p和STAT3的靶向关系。在信号通路的验证实验中,PI3K/AKT的表达检测同样使用了Western blotting技术,mi R-211表达检测使用的是RT-PCR技术。研究结果第一部分NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211基因表达水平对脓毒症/创伤小鼠模型生存状况、促炎因子表达水平的影响1.创伤和脓毒症使小鼠模型的存活率:经过统计发现,SHAM组的小鼠中未发生死亡,TH组中发现了2只(6.67%)死亡,LPS组有4只(13.33%)死亡,TH+LPS组有22只(73.33%)死亡,提示脓毒症导致小鼠死亡率增高,同时创伤会进一步提高脓毒症小鼠模型的死亡率。2.创伤和LPS促进相关小鼠模型中炎症因子表达:与SHAM组相比,TH组和LPS组小鼠的血清TNF-α,IL-1β和IL-6的表达水平升高,而TH+LPS混合干预组水平最高(P<0.05)。在肝组织中的炎症因子检测、肝功能损伤指标方面也都出现了相同的趋势。更进一步分析,在脾细胞增殖能力评估上,相比于SHAM组,TH组和LPS组脾细胞活性显著降低,TH组和LPS组比SHAM组脾细胞释放的IFN-γ和IL-2量少,而TH+LPS组脾细胞比TH组或LPS组释放的量更少(P<0.05)。基于这些结果,本研究推测:创伤和脓毒症都会促进炎症因子的产生,同时,相比与创伤或者脓毒症单一干预,创伤后的脓毒症可能使小鼠模型产生更多的促炎因子,炎症反应更加剧烈。3.NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211基因表达水平与创伤和脓毒症小鼠模型生存状况的相关性:TH组和LPS组的小鼠NEAT1的含量均高于SHAM组,且TH+LPS处理的小鼠显示出更高的NEAT1水平(P<0.05)。同时,在mi R-495-3p和mi R-211含量方面,TH组和LPS组的小鼠NEAT1的含量均低于SHAM组,并且TH+LPS处理的小鼠显示出更低的mi R-495-3p和mi R-211水平(P<0.05)。在生存关系分析上:携带高水平NEAT1的小鼠的存活率比低水平NEAT1的小鼠差,而低水平mi R-495-3p和mi R-211小鼠存活率相对较低。结果表明:检测NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211的基因水平可能对预测小鼠模型的生存状况有意义。4.NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211的基因表达水平与创伤和脓毒症小鼠模型产生的促炎因子水平相关性研究:NEAT1,mi R-495-3p,mi R-211,脓毒症特征性的炎性细胞因子(即TNF-α,IL-6,IL-10和MCP-1)之间存在相关性,p-PI3K,p-AKT和STAT3在SHAM组的小鼠模型中并不明显。在TH组和LPS组的小鼠中,相关性变得更强,上述分子的相关性在LPS+TH组中最为明显。在混合组发现:NEAT1和炎性细胞因子呈现正相关,mi R-495-3p,mi R-211和炎性细胞因子呈现负相关。进一步证实了NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211水平能够反映了小鼠模型中炎症反应情况的可行性。第二部分NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211在炎症细胞模型中的作用1.NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211及相关炎症因子在细胞模型中的表达情况:在炎性细胞模型中检测到上调的NEAT1水平以及下调的mi R-495-3p和mi R-211水平(P<0.05),同时也发现了p-PI3K,p-AKT等炎症通路磷酸化蛋白,TNF-α,IL-10和IL-6等促炎因子和MCP-1炎症趋化因子的高表达。2.LPS和NEAT1的相关性探究:LPS组和NEAT1(+)组都可以刺激NEAT1表达量的升高,两者共刺激后表达量水平更高。3.NEAT1在炎症细胞模型中对mi R-495-3p和mi R-211表达的影响:LPS组和NEAT1(+)组mi R-495-3p表达量较对照组下降,但LPS+NEAT1(-)组表达量升高,相同的趋势在mi R-211表达中也有表达。表明LPS和NEAT1都可以引起mi R-495-3p和mi R-211表达量的下降,但NEAT1对mi R-495-3p和mi R-211表达的影响可能超过LPS。4.mi R-495-3p和mi R-211在炎症模型中对NEAT1表达的影响:mi R-495-3p组、mi R-211组和对照组在NEAT1的表达量上无差异,提示mi R-495-3p和mi R-211对NEAT1的表达无影响。5.NEAT1对RAW264.7细胞中细胞因子的影响:整体趋势相似,发现升高NEAT1水平导致细胞因子(p-PI3K、p-AKT、STAT3、TNF-α、IL-6、IL-10和MCP-1)表达升高,在pc DNA3.1-NEAT1和LPS的双重干预产生的细胞因子表达变化最为明显(P<0.05)。相反,沉默NEAT1似乎可以逆转LPS对产生细胞因子的促进作用(P<0.05)。6.mi R-495-3p和mi R-211对RAW264.7细胞中细胞因子的影响:升高mi R-495-3p和mi R-211的水平均导致p-PI3K,p-AKT,STAT3,TNF-α,IL-6,IL-10和MCP-1的低表达,并且在mi R-495-3p(-)和mi R-211(-)中发现p-PI3K,p-AKT,STAT3,TNF-α,IL-6,IL-10高表达(P<0.05)。结合上述结果提示,NEAT1、mi R-495-3p和mi R-211可以有效地影响LPS处理的炎症细胞模型中的相关反应。7.NEAT1作为海绵对mi R-495-3p/mi R-211表达的影响pc DNA3.1-NEAT1的转染使mi R-211和mi R-495-3p水平显著降低,而沉默NEAT1后却大大提高了mi R-211和mi R-495-3p的水平(P<0.05)。然而,当mi R-211和mi R-495-3p的水平升高或降低时,NEAT1的水平很少改变(P<0.05)。因此,小鼠单核巨噬细胞中的NEAT1,mi R-495-3p和mi R-211之间存在靶向调控关系。第三部分NEAT1对mi R-495-3p和mi R-211相关信号轴的调控作用1.NEAT1对mi R-495-3p/STAT3信号轴的调控:STAT3表达在LPS诱导的炎症细胞模型中显著提高(P<0.05)。用pc DNA3.1-NEAT1和mi R-495-3p抑制剂处理巨噬细胞也显著改善了STAT3的体外表达,相反,在用si-NEAT1和mi R-495-3p mimic干预后,STAT3的表达量出现下降。在反向验证中,pc DNA-STAT3组巨噬细胞中的STAT3表达有所提高,但在si-STAT3的作用下呈现下降(P<0.05)。尽管如此,转染pc DNA-STAT3或si-STAT3时,NEAT1或mi R-495-3p的基因水平相对稳定(P>0.05),提示STAT3不能反向调控NEAT1。通过荧光素酶报告实验,发现p GL3-STAT3-MUT+mi R-495-3p mimic3组和p GL3-STAT3-WT+mi R-NC组相比,mi R-495-3p mimic3+p GL3-STAT3-WT转染的巨噬细胞的荧光素酶活性减弱(P<0.05)。这些结果提示,NEAT1可能通过mi R-495-3p/STAT3信号轴调节炎症反应。2.NEAT1对mi R-211/PI3K/AKT信号轴的调控:si-NEAT1和mi R-211 mimics的转染可以使巨噬细胞中的PI3K/AKT表达降低,而pc DNA3.1-NEAT1和mi R-211mimics处理的巨噬细胞中p-PI3K和p-AKT表达却得到增强(P<0.05)。进一步的,使用PI3K/AKT抑制剂进行干预虽然能够降低PI3K/AKT表达,但未能改变NEAT1和mi R-211的基因水平(P>0.05)。此外,PI3K/AKT抑制剂可逆转pc DNA3.1-NEAT1对p-PI3K,p-AKT,TNF-α,IL-6,IL-10和MCP-1表达能力的影响(P<0.05)。加入PI3K/AKT活化剂后,mi R-211mimic对TNF-α,IL-6,IL-10和MCP-1表达的促进作用也受阻(P<0.05)。因此,这提示PI3K/AKT信号介导了NEAT1和mi R-211对RAW264.7细胞中炎症反应的影响。研究结论综上所述,通过动物模型和细胞模型,本研究初步探究了炎症反应在脓毒症和创伤中的重要作用,同时验证了NEAT1能够通过修饰mi R-495-3p/STAT3轴和mi R-211/PI3K/AKT轴来改变脓毒症中特征性细胞因子的表达,丰富了非编码RNA在炎症反应中的调控机制。