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坦布苏病毒病是由坦布苏病毒(Tembusu virus)引起的以鸭、鹅等产蛋下降及出血性卵巢炎为特征的新出现的传染病。根据其临床及剖检症状,学者们曾提出了鸭产蛋下降综合征、鸭出血性卵巢炎、鸭病毒性脑炎、鸭鹅脑炎-卵巢炎综合征、鸭传染性产蛋减少症等名称。该病的流行给养殖业造成了巨大的损失,而目前尚没有有效的疫苗及药物控制该病的发生。E蛋白是坦布苏病毒的主要结构蛋白之一,位于成熟病毒粒子的表面,它参与病毒的吸附和穿入等过程,影响病毒毒力及细胞嗜性,能刺激机体产生中和抗体,诱导保护性免疫应答。本研究通过连续传代培养获得了能在Vero细胞上稳定传代的坦布苏病毒,成功获得了原核表达的截短E蛋白,并研制出了针对E蛋白的单克隆抗体,为进一步研究E蛋白结构和功能、建立坦布苏病毒的诊断方法、研制新型疫苗奠定了基础。1.坦布苏病毒在Vero细胞上的适应性培养将鹅源坦布苏病毒SHYG株第4代无菌尿囊液接种于Vero细胞并进行连续传代,分别取第5、10、15、20、25、30、35、40和45代病毒测定其TCID50。结果显示,第1代病毒培养1周后才能观察细胞病变；传至第20代时,细胞病变时间提前到第3天；通过RT-PCR扩增E蛋白全基因鉴定,确定引起细胞病变为坦布苏病毒；TCID50测定显示第5代病毒的滴度为101.67TCID50/mL,第30代病毒的滴度为106.33TCID50/mL,病毒滴度呈现一个逐渐升高并稳定的过程,表明坦布苏病毒已适应Vero细胞培养。2.坦布苏病毒截短E蛋白的原核表达PCR扩增出804bp的截短E蛋白基因,插入pET-32a (+)表达载体构建重组表达质粒pET-32a-E,利用原核表达系统进行诱导表达后,得到了主要以包涵体形式存在的重组蛋白,SDS-PAGE显示,重组E蛋白大小约为48kDa。包涵体经过溶解、纯化及复性,获得了浓度为1.239mg/mL的E蛋白,将坦布苏病毒免疫小鼠所得的血清作为一抗进行Western blot,结果表明获得的重组蛋白有良好的抗原性。3.坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备以纯化的E蛋白免疫6-8周龄BALB/c雌鼠,100μg/只,每两周免疫一次,三免后加强免疫一次,取小鼠的脾细胞与SP2/0进行细胞融合。以纯化的E蛋白作为筛选时的抗原,HIS标签蛋白作为阴性对照,采用间接ELISA方法筛选出与E蛋白反应呈阳性,与HIS蛋白反应呈阴性的孔进行亚克隆,最后获得3株针对E蛋白的单克隆抗体,分别命名为1D9B5、1E6C3、3G8F7。其腹水的间接ELISA效价分别为1：64000、1：32000及1：64000；亚类鉴定结果表明,1D9B5单抗和3G8F7单抗属于IgG1亚类,1E6C3单抗属于IgG2a亚类；间接免疫荧光结果显示,3株单抗均能与感染坦布苏病毒的Vero细胞反应产生特异性绿色荧光,与感染禽流感病毒的Vero细胞反应则无荧光；Western blot显示3株单抗均能与E蛋白反应,而不与HIS标签蛋白反应。综上所述,本研究通过连续传代的方法得到了能在Vero细胞上稳定传代的病毒,成功构建了E蛋白基因的原核表达质粒并获得纯化的有活性的重组E蛋白,研制了3株针对E蛋白的单克隆抗体。