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研究背景:脑卒中是一种具有高发病率、死亡率、致残率的常见神经系统疾病,其中约87%是缺血性卒中。尽早恢复缺血区脑灌注,挽救缺血半暗带濒死神经元是脑梗死治疗的重心和目标。多项动物实验证实促进脑梗死后血管新生可减轻神经功能缺损,缩小脑梗死体积。三七三醇皂苷(Panaxatriol Saponins,PTS),是从中药三七中提取的有效成份,其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re为PTS的主要组成成分,前期多项研究证实PTS对脑梗死大鼠具有保护作用,但具体机制不明。近期研究表明PTS三种主要成分均有促人脐静脉内皮细胞增殖作用,然而目前尚未有PTS在缺血脑损伤动物体内促血管新生方面的报道。目的:(1)观察PTS对大鼠脑缺血再灌注模型的保护作用;(2)明确PTS促进脑梗死后微血管新生改善脑灌注作用;(3)探讨PTS促进脑梗死后血管新生相关机制。方法:取SPF级SD雄性大鼠,随机分为(1)假手术组:腹腔注射生理盐水,每日1次;(2)MCAO(大脑中动脉梗死)模型组:MCAO+等量生理盐水,腹腔注射,每日1次;(3)PTS治疗组:MCAO+PTS,腹腔注射PTS,50mg/kg/d。缺血再灌注后不同时间点进行神经行为学评分及脑组织TTC染色评价PTS对大鼠脑梗死的治疗作用;采用Micro-PET影像技术评价PTS对脑血流灌注的影响;RT-PCR和Western blot技术检测不同时间点血管生长相关因子基因及蛋白表达的变化;免疫荧光染色法评价脑梗死缺血半暗带区微血管密度的改变;为进一步评价PTS促血管内皮细胞增殖作用,予MCAO大鼠Brdu腹腔注射,行Brdu与CD31免疫荧光共定位,评价新生血管内皮细胞数目;为深入探讨PTS促血管新生机制,采取环靶明(Shh通路特异性阻断剂)联合PTS予MCAO大腹腔注射,Western blot技术评价Shh信号通路关键蛋白的表达及其对下游血管生长因子的影响。结果:(1)PTS对MCAO大鼠的脑保护作用:TTC及Neuron染色结果表明,PTS能够明显减小缺血再灌注后3天、7天、14天时间点的大鼠脑梗死体积,与对照组比较有统计学意义;Longa神经功能评分表明,PTS给药3天开始能够改善MCAO大鼠神经行为学评分,并持续到14天,与对照组比较P<0.05,有统计学意义。(2)PTS增加MCAO大鼠缺血侧脑灌注:Micro-PET/CT扫描结果显示,MCAO造模后1天18F-PDG脑摄取明显减少,术后14天复查Micro-PET可见PTS治疗组18F-PDG脑摄取量明显增加,表明脑血流量明显改善,经与对照组比较P<0.05,有统计学意义。(3)PTS增加缺血侧皮层血管生长相关因子的mRNA表达水平:RT-PCR结果表明,MCAO术后VEGF的mRNA水平随时间延长,呈持续增高样趋势,并且在第3天时间点PTS治疗组与对照组之间产生差异(P<0.05),治疗组优于对照组,并且这种效果可以延续到14天;Ang-1的mRNA水平表达趋势同VEGF;VEGFR2、Tie-2、CD31的mRNA表达水平在MCAO术后持续增高,并且在第7天达到高峰,14天时有所下降,治疗组与对照组从第3天开始产生差异,治疗组升高的幅度大于对照组(P<0.05);α-SMA的mRNA水平在MCAO术后的表达的趋势等同于Ang-1,同样在第3天开始,治疗组与对照组间产生差异,治疗组升高的幅度明显大于对照组(P<0.05)。(4)PTS上调缺血侧大脑皮层VEGF、Ang-1及VEGR2、Tie-2蛋白表达:western blot免疫印迹结果显示,MCAO术后大鼠大脑皮层VEGF蛋白水平在术后第7天达到高峰,第14天有下降趋势,PTS与对照组比较在第3天,7天,14天时间点有统计学意义(P<0.05);Ang-1的蛋白表达水平随时间延长呈逐渐增加趋势,且PTS与对照组比较在第3天,7天,14天时间点有统计学意义(P<0.05);在术后7天时间点,PTS治疗组能够明显上调VEGFR2、Tie-2蛋白表达水平,经统计学处理优于对照组(P<0.05)。(5)PTS增加缺血侧皮层微血管密度:研究结果表明缺血缺氧诱导病灶周围大量的血管新生,而且微血管密度在脑梗死后7天达到高峰,14天时有所下降,PTS治疗组在第7天和14天时间点CD31/α-SMA阳性的微血管密度明显高于对照组(P<0.05)。(6)PTS增加缺血侧皮层血管内皮细胞增殖:CD31与Brdu免疫荧光共染显示MCAO术后存在血管内皮细胞增殖,PTS治疗组CD31与Brdu共定位细胞明显多于对照组,两组比较P<0.05,有统计学意义。(7)PTS激活Shh信号通路,上调血管生长因子表达:术后7天westernblot检测Shh通路主要信号蛋白(Shh、Smo、Ptch-1)表达,结果显示,术后PTS能够明显上调Shh、Smo、Ptch-1表达,环靶明靶向阻断Shh信号后明显减少PTS诱导的VEG及Ang-1表达,表明PTS可能主要通过激活Shh信号通路促进脑梗死后血管新生。结论:研究结果表明,脑梗死后PTS能够通过激活Shh信号通路,上调缺血侧脑组织VEGF/VEGFR2和Ang-1/Tie-2系统的表达,增加脑微血管密度,改善缺血区脑灌注,进而减小脑梗死体积,改善神经行为学评分。该实验结果为PTS的临床推广应用提供更多的理论依据,为中医药治疗脑梗死的研究提供新的思路和方法。