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目的:构建hIL-10真核表达载体,探索在毕赤酵母中表达重组hIL-10蛋白,经纯化浓缩,获得较高纯度的目的蛋白并进行抗皮肤移植排斥的初步研究,为进一步研究hIL-10生物学功能和生物制品开发及临床应用奠定基础。
方法:(1)设计PCR引物,以质粒pORF-hIL-10为模板扩增hIL-10cDNA;(2)利用EcoRI/XbaI双酶切目的基因,并亚克隆至同样双酶切的载体pPICZaA中,构建真核表达质粒pPICZaA-hIL-10,转入E.coli DH5a进行质粒扩增,小量抽提重组质粒进行双酶切鉴定和DNA序列测定;(3)线性化重组质粒pPICZaA-hIL-10,电转化法,将其转入毕赤酵母,利用载体的ZeocinTM抗性筛选阳性转化子;(4)对所获阳性转化子进行高抗性筛选、Mut表型和PCR鉴定;(5)利用甲醇诱导目的基因表达,收集培养上清,SDS-PAGE和Western-Blot法分析鉴定目的蛋白,ELISA法检测目的蛋白表达水平;(6)用镍离子亲和层析柱FF纯化目的蛋白,聚乙二醇(PEG)浓缩后,SDS-PAGE、Bradford法和ELISA法分析纯化产物中目的蛋白的纯化效率;(7)设计同种异基因小鼠皮肤移植试验,用提取的重组hIL-10蛋白通过皮下注射的用药途径,观察重组蛋白对同种异基因小鼠皮肤移植排斥的影响。结果:(1)扩增出了hIL-10 cDNA,经琼脂糖凝胶电泳在550bp处可见单一条带,大小与预计相符合。用特异性引物测序,
结论:(1)成功构建了hIL-10的真核表达质粒pPICZaA-hIL-10。(2)分别获得Mut+和Mut+型转化子SMD1168/pPICZaA-hIL-10。(3)获得了一定量的hIL-10蛋白制品。(4)动物实验证实重组hIL-10对同种异基因小鼠皮肤移植排斥有抑制作用,可延长移植皮片存活时间。