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肾小管间质纤维化是糖尿病肾病患者最重要的病理特点之一。促纤维化因子如转化生长因子β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）等多种生长因子共同参与了肾脏纤维化过程。肾小管间质纤维化是包括糖尿病肾病在内的多种终末期肾脏疾病的共同的机制,其严重程度不仅与进展性肾功能不全的风险相关,而且关系到患者的生存及预后。然而,现阶段人们对于DKD患者肾小管间质纤维化机制的研究尚不明确,亦没有针对肾小管间质纤维化的靶向药物。随着对肾脏疾病机制研究的逐渐深入,细胞周期异常在该病发生发展中的作用逐渐受到重视。近期杨等人在多种小鼠急性肾损伤模型中研究发现,近端肾小管上皮细胞细胞周期阻滞于G2/M期,JNK信号通路激活诱导胶原蛋白I/IV和促纤维化因子:TGF-β、CTGF的产生,导致肾脏修复不完全、肾小管间质炎症持续进展,伴随成纤维细胞的增殖和细胞外基质的过度沉积,最终发展为终末期肾衰竭。Judit Megyesi等人在UUO小鼠肾脏模型中发现肾脏间质纤维化的进展依赖于p21WAF1/Cip1的表达。虽然以上研究表明细胞周期参与了小管间质纤维化的过程,但其中的具体机制尚不清楚。ING2蛋白作为生长抑制因子家族的第二成员,参与了细胞周期、细胞凋亡和细胞衰老等一系列的过程。目前,关于ING2蛋白的研究主要集中在参与的基因毒性、应激反应及癌症的新型靶向药物等方面。在DNA损伤的情况下ING2表达量较正常修复后显著增加,通过p53赖氨酸-382位点的乙酰化而激活p53,p53激活后可以诱导G1期细胞周期阻滞。ING2也可以通过p21启动子区的H3K4三甲基化募集Sin3a/HDAC1复合物来调节细胞周期的G1/S期检查点。ING2还可以促进TGF-β依赖的转录进程和细胞周期的阻滞。基于上述前期实验研究,本文主要探究细胞周期调节蛋白ING2是否通过周期参与调节间质纤维化过程。本实验用高糖刺激肾小管上皮细胞（HK2）模拟糖尿病状态,检测细胞周期的改变和ING2蛋白的表达之间的关联,通过体内及体外实验验证生长抑制因子ING2在正常和高糖状态下的表达情况、高糖刺激HK2细胞细胞周期、EMT的变化,观察ING2是否参与高糖引起HK2细胞细胞周期变化、EMT表型的变化及其潜在机制,为DKD的相关机制的研究提供新的思路。研究方法1、细胞培养及分组:将HK2分为低糖组（LG,5.5mmol/L Glucose）、高糖组（HG,30mmol/L Glucose）、低/高糖+ING2小干扰RNA对照组（LG/HG+CTR）、低/高糖+ING2小干扰RNA组（LG/HG+ING2kd）。于5%CO2、37℃培养箱中并用含10%胎牛血清的DMEM BASIC培养基进行培养,换液两天一次,传代三天一次。2、采用免疫组化验证糖尿病小鼠肾组织切片中ING2的表达;通过Western Blot、免疫荧光等方法检测高糖培养的人肾小管上皮细胞中ING2、p21、Vimentin、α-SMA等蛋白的变化。3、采用siRNA干扰HK2,从而降低肾小管上皮细胞内ING2的表达后采用RT-PCR、Western Blot、免疫荧光等技术检测干扰效率。4、通过CCK8细胞增殖检测技术、EdU细胞增殖检、流式细胞检测等技术观察对不同刺激条件下人肾小管上皮细胞的增殖能力及细胞周期的改变。研究结果1、高糖环境下HK2增殖能力和细胞周期的变化:CCK8检测和EdU检测结果均显示HG组较LG组增殖能力降低（p<0.05）,流式细胞检测结果显示HG组G0/G1期细胞数目较LG组增多（p<0.05）。2、体内及体外实验验证高糖环境下相关蛋白的变化:免疫组化结果显示糖尿病组肾组织切片与正常组相比,ING2、α-SMA的表达量升高（p<0.05）。Western blot、免疫荧光实验结果显示,高糖环境下ING2蛋白的表达量升高（p<0.05）。3、siRNA下调ING2的表达:用ING2特异的siRNA处理HK2后,用RT-PCR、免疫荧光、Western blot检测ING2干扰效率,数据显示ING2降低了达60%。4、高糖环境下ING2敲降后细胞周期和细胞增殖的改变:CCK8检测和EdU检测结果均显示HG组较LG组增殖能力降低,但通过下调ING2的表达可以恢复增殖能力（p<0.05）;流式细胞检测结果显示HG组G0/G1期细胞数目较LG组增多,ING2敲低可以改善高糖引起的的细胞周期阻滞（p<0.05）。5、高糖环境下ING2敲降后细胞内EMT相关蛋白的变化:在mRNA水平上,HG组较LG组TGF-β1和CTGF的表达水平上调,ING2kd+HG组较CTR+HG组下调（p<0.05）;在蛋白水平,HG组较LG组vimentin和α-SMA的表达量上升,ING2kd+HG组较CTR+HG组降低（p<0.05）。6、高糖刺激ING2敲降HK2细胞内p53-p21轴的变化:在mRNA水平上,HG组较LG组p21的表达水平上调,ING2kd+HG组较CTR+HG组下调（p<0.05）;在蛋白水平,HG组较LG组ac-p53和p21的表达量上升,ING2kd+HG组较CTR+HG组降低（p<0.05）,但p53总量无明显变化。研究结论1、高糖环境下,HK2细胞周期阻滞,增殖能力降低和上皮间质转化。2、生长抑制因子2参与了高糖引起的细胞周期阻滞、细胞增殖能力降低的过程。3、用siRNA干扰HK2细胞内ING2的表达可减弱高糖环境对细胞增殖能力、细胞周期和间质纤维化的影响,而这种影响可能是通过抑制高糖激活的HK2 p53-p21轴来实现的,即ING2可以通过调控p53-p21轴来影响细胞周期和糖尿病肾病纤维化。