奶牛乳房炎是造成奶牛业经济损失最大的疾病之一,由多种病原菌微生物引起,涉及很多种属的细菌,现有的检测方法尚不能满足快速高效检测多种可能存在的致病菌的需要。我们采用基因芯片技术,建立了一套相对快速、高效、同时检测和鉴定奶牛乳腺炎主要致病菌的方法。以细菌的16S rDNA基因为检测的主要靶基因,同时也涉及了23S rDNA,设计筛选出了一套用于检测鉴定奶牛乳房炎主要致病菌的属或种的寡核苷酸探针,制备了检测奶牛乳房炎主要致病菌的基因芯片。在引物对样品中的细菌相应的基因片段扩增的同时,进行靶基因的生物素标记,扩增的产物与硝酸纤维素膜上的探针进行杂交,酶联、显色后根据芯片扫描仪的判读结果来确定奶牛乳房炎致病菌感染的种类。 实验中,首先检测了通用引物的广谱性、通用引物PCR扩增灵敏度及特异探针的特异性,证明这些引物和探针符合本实验的需要。其次,我们建立了一套基于16S rDNA的检测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、乳房链球菌、停乳链球菌6种致病菌的基因芯片检测方法,对杂交条件进行了优化,研制了与之相应的价格低廉、易于推广的小型操作平台。对建立的芯片检测方法的特异性、灵敏度进行了评测,基因芯片检测灵敏度是PCR检测的10倍,金黄色葡萄球菌为0.3cfu/ml,铜绿假单胞菌为0.2cfu/ml,6种致病菌都表现了较强的杂交图谱。 临床上,我们对致病菌的诊断通常是依据细菌培养的结果,按照国家规定的标准的微生物学检测方法进行检测。但实际中由于临床用药等原因,会出现有临床症状但细菌培养无细菌生长的情况,给细菌种类鉴定及临床诊断带来困难。采用基因芯片技术对奶样中致病菌进行检测,则克服了传统细菌培养方法的不足。经应用实验证明,基因芯片对6种细菌的检出率略高于传统方法检测的结果,其原因为临床用药所致。排除这一原因造成的两者检测结果差异,我们收集的122份奶牛乳房炎奶样,基因芯片的检测鉴定结果与综合鉴定结果基本一致。 总之,利用基因芯片对奶牛乳房炎主要致病菌进行检测,能够在6～7小