论文部分内容阅读
目的：“肝主疏泄，调畅情志”是中医脏象理论主要命题，揭示其深入微观机制是推动脏象理论由现象描述迈向本质阐明的必由之路。因此，围绕“肝主疏泄，调畅情志”脑中枢机制这一关键科学问题，本文拟以肝疏泄失常典型病证PMDD肝气逆证为切入点，制备病证结合动物模型，综合应用行为药理、ELISA（酶联免疫法）、免疫荧光、Western blot、RT-qPCR等多种实验手段从5-HT3R、CB1R协同介导情绪调控脑区GABA释放探讨PMDD肝气逆证发病机制。以期解释肝疏泄失常部分中枢机制，为临床有效防治此类情志病证提供可能理论指导，从而为深化七情致病理论提供实验证据支撑，为针对性药物开发提供实验线索依据。
方法：采用行为药理及分子生物学方法开展以下工作①生理状态下应用5-HT3R/CB1R激动剂、拮抗剂和对证中药干预，ELISA技术检测小鼠情绪调控相关海马脑区GABA含量，探索生理状态下5-HT3R、CB1R如何协同介导相关脑区GABA释放及对证中药的可能机制；②运用5-HT3R、CB1R特异性激动剂、拮抗剂干预居住入侵PMDD肝气逆证大鼠模型，检测模型动物攻击及焦虑样行为，探究5-HT3R、CB1R激动或拮抗对病证动物模型的可能干预效应；③运用免疫荧光、RT-qPCR、Western blot检测病证模型大鼠相关脑区5-HT3R、CB1R mRNA及蛋白定性、定位分布模式及表达水平，阐释大鼠情绪调控脑区5-HT3R、CB1R表达、功能与PMDD肝气逆证相关性。
结果：①ELISA检测生理状态下小鼠海马脑区GABA的含量发现：给予特异性激动拮抗剂后，5-HT3R激动剂PBG组海马脑区GABA含量显著性上升（p＜0.05），5-HT3R拮抗剂Granisetron组海马脑区GABA含量显著性降低（p＜0.05），CB1R激动剂WIN组海马脑区GABA含量显著性降低（p＜0.05），CB1R拮抗剂Rimonabant组海马脑区GABA含量显著性上升（p＜0.05），PBG合WIN组及Granisetron合Rimonabant组海马脑区GABA含量无显著变化（p＞0.05，p＞0.05）；BXD联用特异性激动拮抗剂后，BXD联用PBG组能够有效提高海马脑区GABA含量，BXD联用Rimonabant组提高海马脑区GABA含量，BXD联用WIN组、BXD联用PBG合WIN组、BXD联用Granisetron组、BXD联用Granisetron合Rimonabant组GABA含量呈现上升趋势，但无显著性变化（p＞0.05，p＞0.05，p＞0.05，p＞0.05）。
②激动剂及中药干预PMDD肝气逆证模型大鼠后观察其行为效应，发现：模型组相较空白组，给药前后混合攻击行为得分均显著上升（p＜0.001，p＜0.001）；给药后， 5-HT3R激动剂（PBG）组、BXD组与模型组相比显著性下降（p＜0.001，p＜0.001）。在OFT测试中：给药前，模型组与空白组相比中央区进入次数及停留时间显著性下降（p＜0.05，p＜0.05）；给药后，中央区进入次数及停留时间模型组与空白组相比显著性下降（p＜0.05，p＜0.05）、5-HT3R激动剂（PBG）组及BXD组与模型组相比显著性上升（p＜0.05，p＜0.05）。在EPM测试中：在给药前后，模型组与空白组相比OE%、OT%显著性下降（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05）；给药后，5-HT3R激动剂（PBG）组、BXD组与模型组相比在OE%中显著性上升（p＜0.01，p＜0.05）、5-HT3R激动剂（PBG）组、BXD组与模型组相比在OT%中显著性上升（p＜0.05，p＜0.01）。
激动剂及中药干预模型大鼠后对基因、蛋白定位分布模式及表达水平的影响发现：在免疫荧光测试中：证实大鼠海马脑区内5-HT3R、CB1R均有分布。在RT-qPCR测试中：在海马脑区内5-HT3R mRNA测试中，模型组与空白组相比显著性降低（p＜0.05），PBG组与模型组相比显著性升高（p＜0.05），BXD组与模型组显著性升高（p＜0.05）；在海马脑区内CB1R mRNA测试中，模型组与空白组相比显著性升高（p＜0.05）。在WB测试中：在海马脑区内5-HT3R蛋白测试中，模型组与空白组相比显著性降低（p＜0.05），PBG组与模型组相比显著性升高（p＜0.05），BXD组与模型组显著性升高（p＜0.05）；在海马脑区内CB1R蛋白测试中，模型组与空白组相比显著性升高（p＜0.05）。
③拮抗剂及中药干预模型大鼠后观察其行为效应，发现：模型组相较空白组，给药前后混合攻击行为得分均显著性上升（p＜0.001，p＜0.001）；给药后，5-HT3R拮抗剂（Granisetron）组与模型组相比显著性上升（p＜0.01）；BXD组与模型组相比显著性下降（p＜0.001）。在OFT测试中：给药前，模型组与空白组相比中央区进入次数及停留时间显著性下降（p＜0.05，p＜0.05）；给药后，模型组与空白组相比中央区进入次数显著性下降（p＜0.01）、5-HT3R拮抗剂（Granisetron）组、BXD组与模型组相比显著性下降（p＜0.05，p＜0.01）；中央区停留时间模型组与空白组相比显著性下降（p＜0.05）、BXD组与模型组相比显著性上升（p＜0.05）。在EPM测试中：给药前，模型组与空白组相比OE%、OT%显著性下降（p＜0.05，p＜0.05）；给药后，模型组与空白组相比OE%、OT%显著性下降（p＜0.01，p＜0.05）、5-HT3R拮抗剂（Granisetron）组与模型组相比在OE%中显著性下降（p＜0.05）、BXD组与模型组相比在OE%中显著性上升（p＜0.05）、BXD组与模型组相比在OT%中显著性上升（p＜0.005）。
拮抗剂及中药干预模型大鼠后对基因、蛋白定位分布模式及表达水平的影响发现：在RT-qPCR测试中：在海马脑区内5-HT3R mRNA测试中，模型组与空白组相比显著性降低（p＜0.05），BXD组与模型组显著性升高（p＜0.05）；在海马脑区内CB1R mRNA测试中，模型组与空白组相比显著性降低（p＜0.05）。在WB测试中：在海马脑区内5-HT3R蛋白测试中，模型组与空白组相比显著性降低（p＜0.01），BXD组与模型组显著性升高（p＜0.05）；在海马脑区内CB1R蛋白测试中，模型组与空白组相比显著性升高（p＜0.05）
结论：①生理状态下，5-HT3R特异性激动剂、CB1R特异性拮抗剂促进海马脑区GABA的释放，给予5-HT3R拮抗剂、CB1R特异性激动剂则抑制GABA的释放，中药BXD联用5-HT3R激动剂或CB1R拮抗剂，能协同增强海马GABA释放；②激动或拮抗相应受体可显著改变情绪调控脑区的相应受体的分布和表达，能促进情绪调控脑区GABA的释放，5-HT3R特异性激动剂和CB1R特异性拮抗剂可有效纠正PMDD大鼠模型的焦虑样情绪行为，中药BXD干预可同时起到激动5-HT3R和拮抗CB1R作用，从而显著改善模型大鼠异常行为表现；③据此推测，PMDD肝气逆证发病机制可能和5-HT3R与CB1R协同介导情绪调控脑区GABA的释放有关，对证中药干预机制则可同时激动5-HT3R和拮抗CB1R，提升相应脑区GABA含量从而起到改善症状作用。
方法：采用行为药理及分子生物学方法开展以下工作①生理状态下应用5-HT3R/CB1R激动剂、拮抗剂和对证中药干预，ELISA技术检测小鼠情绪调控相关海马脑区GABA含量，探索生理状态下5-HT3R、CB1R如何协同介导相关脑区GABA释放及对证中药的可能机制；②运用5-HT3R、CB1R特异性激动剂、拮抗剂干预居住入侵PMDD肝气逆证大鼠模型，检测模型动物攻击及焦虑样行为，探究5-HT3R、CB1R激动或拮抗对病证动物模型的可能干预效应；③运用免疫荧光、RT-qPCR、Western blot检测病证模型大鼠相关脑区5-HT3R、CB1R mRNA及蛋白定性、定位分布模式及表达水平，阐释大鼠情绪调控脑区5-HT3R、CB1R表达、功能与PMDD肝气逆证相关性。
结果：①ELISA检测生理状态下小鼠海马脑区GABA的含量发现：给予特异性激动拮抗剂后，5-HT3R激动剂PBG组海马脑区GABA含量显著性上升（p＜0.05），5-HT3R拮抗剂Granisetron组海马脑区GABA含量显著性降低（p＜0.05），CB1R激动剂WIN组海马脑区GABA含量显著性降低（p＜0.05），CB1R拮抗剂Rimonabant组海马脑区GABA含量显著性上升（p＜0.05），PBG合WIN组及Granisetron合Rimonabant组海马脑区GABA含量无显著变化（p＞0.05，p＞0.05）；BXD联用特异性激动拮抗剂后，BXD联用PBG组能够有效提高海马脑区GABA含量，BXD联用Rimonabant组提高海马脑区GABA含量，BXD联用WIN组、BXD联用PBG合WIN组、BXD联用Granisetron组、BXD联用Granisetron合Rimonabant组GABA含量呈现上升趋势，但无显著性变化（p＞0.05，p＞0.05，p＞0.05，p＞0.05）。
②激动剂及中药干预PMDD肝气逆证模型大鼠后观察其行为效应，发现：模型组相较空白组，给药前后混合攻击行为得分均显著上升（p＜0.001，p＜0.001）；给药后， 5-HT3R激动剂（PBG）组、BXD组与模型组相比显著性下降（p＜0.001，p＜0.001）。在OFT测试中：给药前，模型组与空白组相比中央区进入次数及停留时间显著性下降（p＜0.05，p＜0.05）；给药后，中央区进入次数及停留时间模型组与空白组相比显著性下降（p＜0.05，p＜0.05）、5-HT3R激动剂（PBG）组及BXD组与模型组相比显著性上升（p＜0.05，p＜0.05）。在EPM测试中：在给药前后，模型组与空白组相比OE%、OT%显著性下降（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05）；给药后，5-HT3R激动剂（PBG）组、BXD组与模型组相比在OE%中显著性上升（p＜0.01，p＜0.05）、5-HT3R激动剂（PBG）组、BXD组与模型组相比在OT%中显著性上升（p＜0.05，p＜0.01）。
激动剂及中药干预模型大鼠后对基因、蛋白定位分布模式及表达水平的影响发现：在免疫荧光测试中：证实大鼠海马脑区内5-HT3R、CB1R均有分布。在RT-qPCR测试中：在海马脑区内5-HT3R mRNA测试中，模型组与空白组相比显著性降低（p＜0.05），PBG组与模型组相比显著性升高（p＜0.05），BXD组与模型组显著性升高（p＜0.05）；在海马脑区内CB1R mRNA测试中，模型组与空白组相比显著性升高（p＜0.05）。在WB测试中：在海马脑区内5-HT3R蛋白测试中，模型组与空白组相比显著性降低（p＜0.05），PBG组与模型组相比显著性升高（p＜0.05），BXD组与模型组显著性升高（p＜0.05）；在海马脑区内CB1R蛋白测试中，模型组与空白组相比显著性升高（p＜0.05）。
③拮抗剂及中药干预模型大鼠后观察其行为效应，发现：模型组相较空白组，给药前后混合攻击行为得分均显著性上升（p＜0.001，p＜0.001）；给药后，5-HT3R拮抗剂（Granisetron）组与模型组相比显著性上升（p＜0.01）；BXD组与模型组相比显著性下降（p＜0.001）。在OFT测试中：给药前，模型组与空白组相比中央区进入次数及停留时间显著性下降（p＜0.05，p＜0.05）；给药后，模型组与空白组相比中央区进入次数显著性下降（p＜0.01）、5-HT3R拮抗剂（Granisetron）组、BXD组与模型组相比显著性下降（p＜0.05，p＜0.01）；中央区停留时间模型组与空白组相比显著性下降（p＜0.05）、BXD组与模型组相比显著性上升（p＜0.05）。在EPM测试中：给药前，模型组与空白组相比OE%、OT%显著性下降（p＜0.05，p＜0.05）；给药后，模型组与空白组相比OE%、OT%显著性下降（p＜0.01，p＜0.05）、5-HT3R拮抗剂（Granisetron）组与模型组相比在OE%中显著性下降（p＜0.05）、BXD组与模型组相比在OE%中显著性上升（p＜0.05）、BXD组与模型组相比在OT%中显著性上升（p＜0.005）。
拮抗剂及中药干预模型大鼠后对基因、蛋白定位分布模式及表达水平的影响发现：在RT-qPCR测试中：在海马脑区内5-HT3R mRNA测试中，模型组与空白组相比显著性降低（p＜0.05），BXD组与模型组显著性升高（p＜0.05）；在海马脑区内CB1R mRNA测试中，模型组与空白组相比显著性降低（p＜0.05）。在WB测试中：在海马脑区内5-HT3R蛋白测试中，模型组与空白组相比显著性降低（p＜0.01），BXD组与模型组显著性升高（p＜0.05）；在海马脑区内CB1R蛋白测试中，模型组与空白组相比显著性升高（p＜0.05）
结论：①生理状态下，5-HT3R特异性激动剂、CB1R特异性拮抗剂促进海马脑区GABA的释放，给予5-HT3R拮抗剂、CB1R特异性激动剂则抑制GABA的释放，中药BXD联用5-HT3R激动剂或CB1R拮抗剂，能协同增强海马GABA释放；②激动或拮抗相应受体可显著改变情绪调控脑区的相应受体的分布和表达，能促进情绪调控脑区GABA的释放，5-HT3R特异性激动剂和CB1R特异性拮抗剂可有效纠正PMDD大鼠模型的焦虑样情绪行为，中药BXD干预可同时起到激动5-HT3R和拮抗CB1R作用，从而显著改善模型大鼠异常行为表现；③据此推测，PMDD肝气逆证发病机制可能和5-HT3R与CB1R协同介导情绪调控脑区GABA的释放有关，对证中药干预机制则可同时激动5-HT3R和拮抗CB1R，提升相应脑区GABA含量从而起到改善症状作用。