论文部分内容阅读
目的：人脐血细胞( human umbilical cord blood cells, HUCBC )中含有丰富的原始造血干/祖细胞、间充质干细胞和大量的内皮祖细胞, 其在体外培养中形成集落的能力、刺激后进入细胞周期的速度以及自分泌生长因子的能力均较骨髓和外周血强，具有广泛的增殖、自我更新和多分化潜能，并具有来源丰富、抗原性弱以及寿命长等优点，已经成为一种干/祖细胞的来源，引起研究者的广泛重视。理论上一直认为人中枢神经细胞属于终末分化细胞，一旦损伤，不能再生修复。然而研究表明，胚胎干细胞和神经干细胞均可分化为神经元和神经胶质细胞，移植给脑损伤动物，均取得良好的效果。骨髓来源的间充质干细胞也被证实可分化为神经元和神经胶质细胞，移植到动物中枢神经系统内，可存活和迁移，并显著减少神经功能缺失。初步研究表明，通过β-巯基乙醇和多聚L-赖氨酸或维甲酸(RA)和神经生长因子(NGF) 诱导，脐血单核细胞可分化为表达神经元和神经胶质细胞分子标志的神经样细胞。然而，是否存在其他更有效的分化诱导方法，其具体机制如何，怎样获得更多的神经细胞以早期应用于临床，有待我们进行更深入的研究。本研究首次采用脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic neurotrophic factor,BDNF)和可溶性核转录因子κB配体受体激动因子(receptor activator of <WP=4>NF-KappaB ligand, sRANKL) 及它们的不同组合在体外对HUCBC中的单个核细胞进行诱导分化试验，免疫组化方法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异核蛋白(NeuN)阳性细胞数目，比较不同诱导分化方法之间的差异，为HUCBC在神经科学领域的应用奠定理论基础。材料与方法：采集足月妊娠、正常分娩胎儿的新鲜脐带血，用6.0%羟乙基淀粉5:1比例加入脐血中,离心沉淀红细胞，然后用Ficoll淋巴细胞分离液（比重1.077）通过密度梯度离心法分离出脐血中单个核细胞，台盼蓝拒染法检测细胞活力。分离所得细胞分5组进行体外诱导分化试验：(1)对照组，普通培养基培养, 为含10%胎牛血清(FCS)、1%谷氨酰胺、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml的最低必需培养基(DMEM)；(2) 神经分化培养基组：加入神经分化培养基培养，不加任何因子，培养基为含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、胰岛素25μg/ml、转铁蛋白100μg/ ml、黄体酮20nM、维甲酸0.5μM、青霉素100u/ml、链霉素100μg /ml的DMEM/F12培养基；(3)BDNF组，分化培养基+ 脑源性神经营养因子(BDNF)； (4)sRANKL组，分化培养基+人可溶性RANKL (sRANKL)；(5) BDNF+ sRANKL组，分化培养基+ BDNF +sRANKL。倒置相差显微镜动态观察细胞生长、分化情况；培养10天后，应用免疫细胞化学染色方法检测培养细胞的GFAP和NeuN表达情况以进行细胞性质鉴定，记数每孔的NeuN或GFAP免疫反应阳性细胞数，计算其在每组4孔中平均阳性细胞数。所有数据结果以均数±标准差表示。采用t检验，以P<0.05为差异显著性标准。<WP=5>结果：1、相差显微镜观察结果：HUCBC分化培养24小时后，各组均可观察到贴壁细胞出现，细胞体积较大，呈圆形、卵圆形、纺锤形或“逗号”样，以含神经分化培养基的各组较多，同时可见明显的细胞死亡；随培养时间的延长，贴壁细胞逐渐增多，含神经分化培养基的各组均有部分细胞出现胞浆突起，呈“极性”生长，随诱导时间延长，这些细胞不断增加，细胞突起增多、伸长，并可见细胞分裂，至第7天时，含神经分化培养基各组均出现典型的神经样细胞。BDNF+sRANKL组尤为明显，此类细胞数目最多，突起最长，BDNF组和sRANKL组相近，均较单纯神经分化培养基组明显，而对照组未观察到此类细胞生长。 2、免疫组化检测结果：含神经分化培养基的各组均检测到GFAP和NeuN反应阳性的细胞。BDNF+ sRANKL组、sRANKL组、BDNF组和神经分化培养基组每培养孔中NeuN免疫反应阳性细胞数依次为167.000±19.672、97.000±13.528、85.000±5.568、55.667±8.505 。BDNF+ RANKL组、RANKL组、BDNF组每培养孔NeuN免疫反应阳性细胞数均多于神经分化培养基组；BDNF+sRANKL组NeuN免疫反应阳性细胞数多于RANKL组和BDNF组，比较具有显著性差异(P<0.01)；而sRANKL组虽较BDNF组NeuN免疫反应阳性细胞数稍多，但两组间比较无统计学意义(P>0.20)。BDNF+ sRANKL组、sRANKL组、BDNF组和神经分化培养基组每培养孔GFAP免疫反应阳性细胞数依次为289.000±24.880、114.667±18.037、233.333±21.733、<WP=6>80.333±11.504。BDNF+ sRANKL组、sRANKL组、BDNF组每培养孔中GFAP免疫反应阳性细胞数均显著多于神经分化培养基组； BDNF+ sRANKL组免疫反应阳性细胞数多于sRANKL组(P<0.001)和BDNF组(P<0.05)；sRANKL组和BDNF组比较，BDNF组GFAP免疫反应阳性细胞数显著多于sRANKL组(P<0.001)。结论: HUCBC 中含有可分化为神经细胞的干/祖细胞，sRANKL和BDNF均可在体外诱导HUCBC分化为神经元和神经胶质细胞，其中BDNF向神经元方向诱导分化的作用与sRANKL组相当，向神经胶质细胞诱导分化的作用大于sRANKL组。二者与单纯神经分化培养基比较有更好的诱导分化作用，并且二者具有协同作用，联合应用时向神经胶质细胞和神经元方向诱导分化的作用较二者的单独应?