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我国南方稻区普遍存在重金属镉(Cd)污染的问题,因此,Cd污染稻田生产的稻米存在Cd超标的风险(>0.2mg/kg)。长期食用Cd超标的大米对人体健康有潜在的危害。由于通过各种修复手段把Cd等重金属从环境中移除,是一个长期而艰辛的工作,因此,培育籽粒Cd低积累水稻品种是解决大米Cd安全的有效手段之一。近几年,在植物Cd吸收、转运相关基因的研究取得了一定进展,然而,有关水稻吸收、转运和积累Cd的分子和生理机制,尤其是水稻籽粒积累Cd的机制,还很不清楚。因此,进一步鉴定Cd积累相关基因,研究其生理功能,可以加深对水稻Cd运输和积累遗传机制的理解,也为通过遗传调控,培育籽粒低镉水稻种质资源提供指导。水稻的根和茎节在离子吸收和籽粒Cd积累中起关键的作用。本研究通过对根和茎节的转录组和Cd候选基因的酵母突变体功能分析,筛选出与Cd耐性相关的基因OsCCX2和OsMDR6,进一步研究它们在水稻Cd积累中的作用及其生理功能。同时,对Cd积累相关基因与温敏不育系水稻籽粒Cd积累的关联性进行分析,获得的主要结果如下:1.OsCCX2参与水稻Cd积累调控。首先,通过CRISPR/cas9基因编辑方法,构建了基因敲除突变体(粳稻日本晴和籼稻337为背景)。突变体籽粒Cd积累分析表明,无论是日本晴还是337水稻,在不同Cd 土壤条件下,其突变体籽粒中Cd含量都要显著低于野生型,表明该基因参与了水稻籽粒Cd积累过程。其次,对不同发育时期水稻各部位的Cd积累特征进行分析,发现突变体中Cd离子从地下到地上的转运率明显低于野生型,表明OsCCX2基因参与Cd从地下到地上的转运。对不同节位水稻Cd积累特性分析发现,突变体最上节Cd所占比例低于野生型,随着节位的下降,所占比例逐渐高于野生型,到第四节和第四节以下所占比例就显著高于野生型,表明OsCCX2基因参与地上不同节位Cd的分配。在Cd胁迫条件下,过表达OsCCX2的ycfl菌株与对照比,能够提高对Cd毒害的耐受性;同时,OsCCX2过表达酵母细胞中的Cd含量要显著降低,暗示OsCCX2参与Cd离子外向转运。结合植株亚细胞组分、茎秆木质部伤流液中Cd含量检测,以及OsCCX2的分布和定位结果,推测OsCCX2很可能在水稻茎节维管束,在调控Cd从薄壁细胞的外向运输和向木质部的装载中起关键作用。2.OsCCX2参与植物体内Ca离子平衡调控的初步分析。OsCCX2是一个假定的Na/Ca交换蛋白。OsCCX2基因过表达水稻与突变体和野生型相比,其根中Ca离子外流信号增加,可能导致细胞内静息态的Ca离子水平发生变化;当Na处理时,都检测到瞬间的Ca内流信号,但过表达植株Ca信号峰值显著低于对照,推测过表达植株胞内的Ca信号峰值也受到影响。OsCCX2突变体旗叶中Ca含量低于野生型,Na含量高于野生型,而OsCCX2过表达旗叶则相反,显示OsCCX2可能具有Na/Ca交换功能。基因敲除突变体中,其Ca的根-茎转运率和茎秆各节的分配比率与Cd的变化规律相似,呈现下降的趋势,表明OsCCX2参与水稻Ca的根/茎转运和茎秆各节间的分配,暗示水稻在节中,利用Ca转运系统向上转运Cd。OsCCX2过表达水稻花粉可育度降低,结实率极低;OsCCX2异源过表达拟南芥植株矮小,不能结实,可能是胞内Ca平衡紊乱导致生长和花粉发育受到影响。3.OsMDR6参与水稻籽粒Cd积累调控研究。当OsMDR6功能缺失时,突变体水稻籽粒中的Cd积累显著下降。OsMDR6在根中特异的高表达,且其表达受Cd的诱导。异源过表达OsMDR6的突变体酵母增强了对Cd的耐性,但酵母细胞的Cd积累与对照比,并未发生显著变化。考虑到osmdr6突变体茎叶等营养器官中的Cd含量与对照比差异不明显,推测OsMDR6并不能直接转运Cd,可能通过其他途径间接影响水稻籽粒Cd积累和酵母细胞对Cd的耐性。除Cd以外,突变体籽粒中Fe和Cu的含量也显著下降,暗示OsMDR6与Fe或Cu的转运或积累相关。突变体地上、地下与缺铁响应有关的基因如OsNS幻、OsNAS2等表达量明显上调。4.OsMDR6生理功能的初步研究。mdr6突变体籽粒的大小明显小于野生型,千粒重也显著下降,主根长度略长于野生型,地上部分没有明显差异。和野生型相比,在高浓度的生长素处理条件下,突变体和根依然比野生型长。而在高浓度的NAA处理条件下,突变体和野生型都受到强烈的抑制作用,根长没有差异。说明OsMDR6基因缺失突变体在表型上更像生长素输入蛋白突变体。同时,与生长素响应的有关基因如OsIAA3、OsIAA23等的表达量也明显上调,说明OsMDR6基因可能与生长素运输相关,通过控制生长素的分布调控籽粒大小和根长短,以及影响Fe和Cd在籽粒的分配。5.Cd积累相关基因与温敏不育系水稻籽粒Cd积累关联分析。首先对174份温敏核不育系水稻籽粒镉含量进行检测,其含量变化从0.063 mg/kg DW 到 1.466 mg/kg DW,平均为 0.23 mg/kg DW。其中 47%的材料籽粒镉含量达标,只有8%的材料严重超标(>0.4mg/kg DW)。其次以日本晴序列为参照序列,检测7个Cd相关基因的多态性,发现在镉污染土壤中,位于OsMRAP5、OsNRAMP1、OsHMA2、OsHMA3四个基因中的9个序列变异位点与温敏核不育系籽粒镉积累性状显著相关或极显著相关。在显著相关的变异位点中,两个变异位点(OsNRAMP1,2573bp;OsNRAMP5,1306bp)对籽粒镉积累性状具有负效应,有望开发成籽粒低Cd筛选分子标记。