研究背景和目的：伴随着新型毒品的不断增多,毒品滥用已然成为全球各个国家共同面临的严峻社会问题,我国的吸毒问题也日趋严重,吸毒者为了筹集毒资,以身试法,参与的刑事犯罪案件逐年递增,毒品本身可以引起精神损害,导致暴力伤害、自杀、他杀行为增加,成瘾者劳动能力丧失,吸毒相关的猝死和戒断性死亡时有发生,不仅增加社会经济负担和社会稳定性风险,而且严重伤害人体的身体健康和精神健康。成为国际上共同关注的严重社会问题,也是医学届包括法医学界越来越关注的重点研究问题。甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH),俗称冰毒,隶属苯丙胺类兴奋剂,是化学合成的一种新型毒品。METH不但具有很强的中枢兴奋作用,吸食后可导致刻板行为、致幻、食欲减退和交感能效应等药理、毒理学特性,而且易形成药物依赖性,甚至可以一次成瘾,剂量大时可出现急性中毒甚至直接导致猝死,。对于长期使用METH者而言,其不但会引起精神行为学上的改变,还会引起中枢神经系统(CNS)的结构和功能的损伤性改变。近年来临床和动物模型研究表明,METH可通过各种途径引起额叶皮质、纹状体及海马等区域内神经细胞的坏死和凋亡,而METH’慢性使用者大脑实质内会出现与帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等神经退行性疾病类似的病理学改变,这可能与METH的神经毒理作用有关,比如多巴胺(Dopamine, DA)耗竭及其受体数量减少、氧化应激(Oxidative Stress, OS)损伤、体温调节失衡导致机体高热、炎症损伤,以及细胞凋亡相关通路的激活等,最终导致相关脑区和类型的神经元受损而出现退行性病变。但目前的研究结果尚不足以系统、完善的阐明METH的神经毒性机制,有待进一步深入的研究。胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth factor, IGF)轴是一类在分子水平调节着细胞的生长、分化和凋亡的多肽,包括IGFs(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)、IGF受体(IGFR). IGF结合蛋白(IGFBP1～7),共同构成IGF系统。IGFBPs可以调节IGFs轴的活性并具有细胞和组织特异性。IGFBP5作为IGFBP5的重要成员之一,也发挥着调节细胞生长、分化及凋亡的重要作用。目前许多的的研究已经证明IGFBP5在啮齿类动物的脑组织发育过程中发挥重要的作用。例如,Zhong等学者在研究中发现：如果将IGFBP5的抗体添加到颗粒神经元的培养基中,则细胞的存活率显著增强；如果加入IGFBP5至培养基中则实验结果刚好相反。因此,他们认为IGFBP5的过表达很有可能诱导了颗粒神经元的早期凋亡。Marshman等人研究发现在离体的小鼠乳腺上皮细胞中加入外源性的IGFBP5or IGFBP3可以抑制IGF-I调节细胞存活的作用,直接导致细胞的凋亡率达3倍以上。随后,Butt等人发现IGFBP5可以激活MDA-MB-231乳腺癌细胞的中的caspase-8和caspase-9,进而通过凋亡通路中的BCL-2机制诱导细胞凋亡。这些发现都与IGFBP5可以诱导细胞凋亡这一效应是一致的。本课题组多年来致力于METH的神经毒性研究,我们在前一阶段的研究中发现,对METH注射后的大鼠纹状体等部位检测发现多巴胺能神经元的凋亡增加,PC12细胞(多巴胺能神经元细胞株)用METH处理后得到相对应的结果,并且发现METH处理后的PC12细胞在24小时内IGFBP5显著升高,但IGFBP5是否参与调节METH诱导的多巴胺能神经元凋亡,如果参与,其作用机制为何等一系列问题并未得到确切答案。于是,本文立足以上研究基础,拟解决IGFBP5是否参与调节METH诱导的PC12细胞凋亡及调节机制等问题,为METH成瘾者的治疗提供新的思路和有效的药物作用靶点。研究内容及方法：一. IGFBP5在METH处理的大鼠脑组织标本和PC12细胞株中的表达情况1.采用全基因组芯片技术检测大鼠所有基因在METH毒性损伤的PC12细胞中的表达,初步确定所有基因的表达水平的变化,以期筛选出差异表达的mRNA。2.采用Real Time PCR(荧光定量PCR)手段验证基因芯片中检测出的IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7mRNA水平的表达。用METH对PC12细胞进行处理,检测基因芯片中信号增强的IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7mRNA的特异性表达情况。3.建立急性METH中毒大鼠模型,选取大鼠纹状体,采用荧光定量PCR手段验证IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7mRNA在大鼠组织标本中的特异性表达情况。4.采用荧光定量PCR手段检测不同浓度METH处理PC12细胞相同时间以及同一浓度METH处理PC12细胞不同时间的情况下IGFBP5mRNA表达情况。同时采用Westen Blot方法IGFBP5蛋白表达情况,确定METH浓度和处理时间对IGFBP5的影响。二.IGFBP5基因沉默的PC12细胞在METH诱导下IGFBP5的表达及细胞的凋亡情况1.针对IGFBP5基因设计并合成三条siRNA干扰序列,采用RNA干扰技术(RNAi)处理PC12细胞,采用荧光定量PCR方法检测出有效干扰序列。2.采用有效干扰序列沉默PC12细胞的IGFBP5mRNA表达后,用METH进行处理,采用Westen Blot方法IGFBP5蛋白表达情况,确定IGFBP5的表达上升在METH的毒性损伤过程中是否为伴随现象。3.采用TUNEL法检测IGFBP5基因沉默的PC12细胞经METH处理后的细胞凋亡情况。三.初步探测IGFBP5在调节METH诱导的细胞凋亡作用中的分子机制1.采用Westen Blot方法检测IGFBP5基因沉默的PC12细胞经METH处理后s细胞色素C分布情况及caspase3、PARP蛋白的表达情况。四.统计学方法采用统计软件SPSS13.0对实验结果进行统计学处理和分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。实验组和对照组刻板行为评分及基因表达量比较采用两独立样本T检验；本文中其他基因、蛋白表达量的分析采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较各组差异,如方差齐性,多重比较采用LSD法,如方差不齐,采用Welch值,多重比较采用Dunnett T3法。P<0.05被认为有统计学差异。结果：一. IGFBP5在METH处理的大鼠脑组织标本和PC12细胞株中的表达情况1.采用基因芯片检测手段检测IGFBPs在METH毒性损伤的PC12细胞中的表达情况。结果显示：IGF结合蛋白中的IGFBP4、IGFBP5及IGFBP7mRNA表达升高,IGFBP1、IGFBP2、 IGFBP3及IGFBP6mRNA表达不升高或不表达。2.采用荧光定量PCR手段验证METH处理的PC12细胞中的IGFBP4、 IGFBP5、IGFBP7mRNA水平的特异性表达情况。结果显示,METH处理的PC12细胞中只有IGFBP5mRNA表达显著升高,IGFBP4以及IGFBP7mRNA表达未见升高。3.建立急性METH中毒大鼠模型,选取大鼠纹状体,采用荧光定量PCR手段验证IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7mRNA在大鼠组织标本中的特异性表达情况。结果显示,实验组大鼠纹状体组织中只有IGFBP5mRNA表达显著升高,IGFBP4以及IGFBP7mRNA表达未见升高。4.采用荧光定量PCR手段检测不同浓度METH处理PC12细胞相同时间以及同一浓度METH处理PC12细胞不同时间的情况下IGFBP5mRNA表达情况。结果显示,IGFBP5mRNA表达量与METH的处理浓度呈浓度依赖特性,与METH的处理时间呈时间依赖特性。同时采用Westen Blot方法IGFBP5蛋白表达情况,确定METH浓度和处理时间对IGFBP5的影响。结果显示,IGFBP5蛋白表达量与与METH的处理浓度呈浓度依赖特性,与METH的处理时间呈时间依赖特性。并且,IGFBP5mRNA和蛋白表达量的上调在时间上符合。二.IGFBP5基因沉默的PC12细胞在METH诱导下IGFBP5的表达及细胞的凋亡情况1.针对IGFBP5基因设计并合成三条siRNA干扰序列,采用RNA干扰技术(RNAi)处理PC12细胞,采用荧光定量PCR方法检测出有效干扰序列。结果证实其中两条siRNA序列能够沉默IGFBP5基因。2.采用有效干扰序列沉默PC12细胞的IGFBP5基因表达后,用METH进行处理,采用Westen Blot方法IGFBP5蛋白表达情况,确定IGFBP5的表达上升在METH的毒性损伤过程中是否为伴随现象。结果显示,IGFBP5基因沉默的PC12细胞与未沉默的细胞相比较,在METH的诱导下,其蛋白表达显著下调。该结果证实IGFBP5在METH的毒性损伤过程中并不是伴随现象,其参与调节METH的毒性损伤过程。3.采用TUNEL法检测IGFBP5基因沉默的PC12细胞经METH处理后的细胞凋亡情况。结果显示,IGFBP5基因沉默的PC12细胞与未沉默的细胞相比较,在METH的诱导下,其细胞凋亡率显著下调。该结果再次证实IGFBP5在METH的毒性损伤过程中并不是伴随现象,并且从反面说明IGFBP5在METH诱导的细胞凋亡作用中起促进作用。三.初步探测IGFBP5在调节METH诱导的细胞凋亡作用中的分子机制1.采用Westen Blot方法检测IGFBP5基因沉默的PC12细胞经METH处理后细胞色素C分布情况及caspase3、PARP蛋白的表达情况。结果显示,IGFBP5基因沉默的PC12细胞与未沉默的细胞相比较,在METH的诱导下,细胞色素C由线粒体内释放至细胞质内,caspase3蛋白表达显著下调,未活化型PARP及活化型PARP蛋白表达均显著下调。初步探明证实IGFBP5通过调节细胞色素C的释放及caspase3、PARP的活性调节神经元凋亡,其作用机制可能与线粒体凋亡途径有关。结论1.IGFBP5在METH处理的大鼠纹状体组织和PC12细胞株中均表达上调,说明IGFBP5确实参与了METH诱导的多巴胺能神经元凋亡过程。2.PC12细胞经IGFBP5基因沉默处理后能降低METH诱导的细胞的凋亡,为IGFBP5参与METH诱导的细胞凋亡过程提供深层证据,并且证明IGFBP5的上调并非为凋亡过程的伴随现象,而是对METH诱导的多巴胺能神经元凋亡具有重要的调节作用。3. IGFBP5基因沉默的PC12细胞与未沉默的细胞相比较,在METH的诱导下,细胞色素C由线粒体内释放至细胞质内,caspase3蛋白表达显著下调,未活化型PARP及活化型PARP蛋白表达均显著下调。初步探明IGFBP5通过激活线粒体凋亡途径,调节细胞色素C的释放及caspase3、PARP的活性而调节神经元凋亡。本研究创新之处1.第一次提出IGFBP5参与了METH的神经损伤过程。2.第一次提出IGFBP5调节了METH诱导的多巴胺能神经元细胞的凋亡。3.第一次证明证实IGFBP5通过调节细胞色素C的释放及caspase3、PARP的活性调节神经元凋亡,其作用机制可能与线粒体凋亡途径有关。