论文部分内容阅读
目的:利用高通量测序技术对HBV相关肝细胞癌组织以及配对癌旁组织的mRNA进行测序分析,筛选差异表达mRNA,并利用生物信息学手段分析差异表达mRNA,揭示肝细胞癌发生发展过程中可能的关键调控通路以及关键差异表达的mRNA,为下一步的研究打下基础。方法:1.肝细胞癌差异表达mRNA分析。对HBV相关肝细胞癌以及配对癌旁组织进行高通量测序(各3例),计算mRNA表达量,筛选差异表达mRNA,构建肝细胞癌mRNA差异表达谱。2.应用生物信息学手段对差异表达的mRNA进行分析。对差异表达的mRNA进行GO功能富集分析﹑KEGG信号通路富集分析以及KO分析等,揭示差异mRNA可能存在差异的功能以及差异表达mRNA主要参与的代谢途径和信号通路;结合富集分析的结果,筛选关键调控通路以及关键差异表达的mRNA。3.扩大样本量验证。对HBV相关肝细胞癌组织及其配对癌旁组织各8例,利用实时荧光定量PCR技术以及免疫组化技术对关键调控通路上的显著差异mRNA在基因和蛋白水平上的表达进行验证,为下一步研究打下基础。结果:1.经过高通量测序分析共筛选到2386个差异mRNA。其中癌旁组相对肝细胞癌组织组有1119个m RNA表达上调,1267个m RNA表达下调。2.差异表达m RNA GO功能富集分析发现,差异表达m RNA主要参与的生物学过程GO Term为:GO:0046395 carboxylic acid catabolic process(羧酸分解代谢过程)、GO:0032787 monocarboxylic acid metabolic process(单羧酸代谢过程)和GO:1901605 alpha-amino acid metabolic process(α-氨基酸代谢过程)等;差异表达m RNA作为细胞组分作用,主要富集在GO:0070062 extracellular exosome(细胞外泌体)、GO:0044444 cytoplasmic part(细胞质部分)和GO:0044459 plasma membrane part(质膜部分)等GO Term上;差异表达m RNA执行的分子功能,主要富集在GO:0016614 oxidoreductase activity,acting on CH-OH group of donors(激活质膜部分氧化还原酶作用于供体的CH-OH基团)、GO:0042802 identical protein binding(相同的蛋白结合)、GO:0043168 anion binding(阴离子结合)、GO:0050662 coenzyme binding(辅酶结合)和GO:0008028 monocarboxylic acid transmembrane transporter activity(激活一元羧酸跨膜转运蛋白)等GO Term上。KEGG信号通路富集分析发现差异表达m RNA主要集中在Valine,leucine and isoleucine degradation(缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸降解)﹑Tyrosine metabolism(酪氨酸代谢)﹑Tryptophan metabolism(色氨酸代谢)﹑Retinol metabolism(视黄醇代谢)﹑Propanoate metabolism(丙酸盐代谢)﹑PPAR signaling pathway(PPAR信号通路)﹑Peroxisome(过氧化物酶体)﹑Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450(细胞色素P450对外源物质的代谢)﹑Glycine,serine and threonine metabolism(甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢)﹑Fatty acid degradation(脂肪酸降解)﹑Drug metabolism-other enzymes(药物代谢-其他酶)﹑Drug metabolism-cytochrome P450(药物代谢-细胞色素P450)﹑Complement and coagulation cascades(补体和凝血级联)﹑Cell cycle(细胞周期)﹑Carbon metabolism(碳代谢)﹑Caffeine metabolism(咖啡因代谢)﹑Butanoate metabolism(丁酸代谢)﹑Bile secretion(胆汁分泌)﹑beta-Alanine metabolism(β-丙氨酸代谢)﹑Arginine and proline metabolism(精氨酸和脯氨酸代谢)等20个信号通路上。KO分析筛选通路发现在细胞周期(Cell cycle)通路上,SFN、CCNB1和CDK1三个m RNA位列上下游并显著上调(肝细胞癌组织相对于配对癌旁组织)。3.利用实时荧光定量PCR技术以及免疫组化技术验证SFN、CCNB1和CDK1基因以及蛋白的表达量发现,相比癌旁组织,SFN、CCNB1和CDK1在肝细胞癌组织中的基因以及蛋白表达量上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.应用高通量测序技术共筛选到2386个差异m RNA,其中癌旁组织组相对于肝细胞癌组织组有1119个m RNA表达上调,1267个m RNA表达下调。2.SFN、CCNB1和CDK1在肝细胞癌组织中高表达,并且都富集于细胞周期通路上。