蝎活性多肽BmKn2及其突变体Kn2-7抗耐药细菌功能与机制研究

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细菌感染一直威胁着人类的健康,而且随着抗生素的滥用,耐药细菌感染变得非常普遍。如近来耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M ethicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)感染人数显著升高。许多耐药细菌感染缺乏有效的治疗手段,新型抗细菌特别是抗耐药细菌感染药物应用基础研究凸现意义重大。抗菌肽是一类天然的宿主防御分子,对细菌、病毒、真菌以及疟原虫等病原体有广谱抑制作用。与传统抗生素不同,抗菌肽不易诱导耐受性,且已有研究表明些抗菌肽能够有效抑制抗生素耐受菌。因此,抗菌肽的筛选、设计与改造在抗细菌感染药物研究中占有重要地位。马氏正钳蝎是一味传统中药,具有重要的药用价值,其毒腺中分泌的毒素多肽为主要有效成份。蝎毒液中富含生物活性多肽,其中小阳离子抗菌肽是一类重要生物活性多肽,通常由9-30个氨基酸构成,具有抗微生物活性。因此,从蝎毒液中筛选天然抗菌肽,通过改造获得高活性低溶血性的衍生多肽,具有重要意义。首先,在对本实验室建立的马氏正钳蝎CDNA文库的EST序列分析的基础上,筛选到一条由70个氨基酸的组成前体多肽分子BmKn2:23个氨基酸的信号肽、13个氨基酸且无二硫键的成熟肽以及34个氨基酸的前肽。采用电刺激法收集马氏正钳蝎毒液,通过反向高效液相色谱方法并结合质谱技术,在蛋白水平上鉴定了马氏正钳蝎毒液中含有BmKn2多肽。通过固相合成法合成BmKn2多肽,并测定BmKn2的体外抗菌活性。实验结果表明,BmKn2多肽能选择性抑制革兰氏阳性细菌的标准株,并且能够有效抑制包括MRSA在内的临床分离革兰氏阳性耐药菌株的生长。建立了MRSA感染小鼠的动物模型,并以此为基础在体内水平上研究了BmKn2对MRSA感染小鼠的治疗效果。结果显示,经BmKn2多肽治疗的MRSA感染小鼠在给药7天后全部存活。阐明了BmKn2多肽在体内外均具有良好的抗菌效果。杀菌、酶释放和电镜的实验结果证明了BmKn2多肽能够在短时间内通过破坏细菌表面结构实现快速杀菌,并且造成细菌破裂释放内容物。揭示了蝎活性多肽BmKn2的抗菌机理。为了提高与扩大蝎活性多肽BmKn2的抗菌活性和抗菌谱并降低其溶血活性,开展了基于BmKn2多肽为分子骨架的抗菌分子设计与改造研究。采用增加多肽分子静电荷和双亲性为原则,通过分子设计将BmKn2多肽分子的Gly3, Ala4和Ser10分别替换为Lys3, Arg4和Arg10,获得了BmKn2多肽的突变体Kn2-7。体外水平检测了突变体Kn2-7的抗菌活性,结果发现突变体Kn2-7不仅抑制标准株革兰氏阳性细菌和提高抗耐药菌的活性,而且也有效抑制革兰氏阴性细菌的生长,扩大了抗菌谱。溶血性实验表明,与野生型BmKn2多肽相比,突变体Kn2-7的半数溶血剂量提高了5倍,显著降低了溶血活性。建立了金黄色葡萄球菌感染小鼠皮肤的模型,以此为基础研究了Kn2-7多肽外用凝胶制剂治疗皮肤感染的效果。经过4天的持续给药,小鼠皮肤创伤愈合,受损的皮肤组织结构恢复完整,并且创面菌落数回落至正常水平。这些结果证明了基于BmKn2多肽为骨架设计改造的Kn2-7多肽在体内外具有良好的抗菌活性,也表明了突变体Kn2-7多肽具有作为外用药物治疗金黄色葡萄球菌引起的皮肤感染的潜力。与野生型BmKn2多肽抗革兰氏阳性菌不同,Kn2-7具备了抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的活性,然而革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的细胞壁结构完全不同,因此研究Kn2-7的抗菌机制有重要意义。通过杀菌实验以及酶释放实验,结果发现与抑制革兰氏阳性菌相同,Kn2-7多肽也能够快速杀火革兰氏阴性菌并造成细菌破裂,内容物释放。然而,通过透射电镜发现Kn2-7多肽可以与大肠杆菌细胞壁结合,并在细菌周围与细菌外膜的碎片形成微球状复合体。然后分子相互作用实验证实了Kn2-7多肽可以分别和革兰氏阳性菌的细胞壁成分磷壁酸(LTA)以及革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖(LPS)结合,而野生型BmKn2多肽只能与革兰氏阳性菌LTA结合。最后,竞争结合实验的结果进一步证实了突变体Kn2-7多肽对革兰氏阳性菌与阴性菌杀菌机制的差异是由细胞壁上的LTA与LPS造成的。在本研究中,探讨了蝎活性多肽BmKn2的抗菌功能和机制,并且在BmKn2多肽的基础上通过分子改造与设计获得了抗菌谱更广,溶血活性更低的突变体Kn2-7多肽。Kn2-7多肽抑制抗生素耐受菌和治疗金黄色葡萄球菌引起的小鼠皮肤感染证实了其具有被开发为抗细菌特别是耐药菌感染药物的潜力。Kn2-7多肽抗菌机制的研究结果为抗菌肽的杀菌机制理论模型提供了清晰的实验证据。
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