研究动物复杂器官功能形成的遗传进化基础是认识复杂生命的重要途径。反刍动物因其独特的前胃发酵系统和反刍行为而得名,其瘤胃是前胃发酵系统的主要器官,它与微生物的紧密协作,使得反刍动物具有了高效消化植物纤维的能力并因此获得了独特的进化优势,促进了反刍动物类群的繁盛和多样性。有关瘤胃功能的基因表达特征已经取得一定进展。然而,关于瘤胃的功能创新的遗传进化机制仍有待研究。因此,本研究利用反刍动物比较基因组、比较转录组和功能验证对反刍动物瘤胃的功能创新进行了探究,并利用瘤胃壁多个发育时间点的转录组和瘤胃内容物的宏基因组数据对早期瘤胃发育重编程的功能建立过程与微生物功能互作的关系进行了深入的研究,包括瘤胃结构和功能相关基因的筛选、进化关键候选基因的识别和功能验证及瘤胃基因表达动态、微生物演替及两者的功能相关性三个部分。1.本研究收集了反刍动物类群所在的鲸偶蹄目的50种组织的897个转录组数据,包括255个本研究首次获得的样本和642个下载自公共数据库的样本,覆盖鲸偶蹄目中的三个拥有多胃室结构的亚目,包括反刍亚目的绵羊和狍子、胼足亚目的双峰驼及鲸河马亚目的布氏鲸和江豚,用于识别瘤胃功能创新的候选基因。首先,利用本研究开发的一个组织特异表达基因筛选指标E50,鉴定到655个瘤胃相对其他组织高表达的基因。其中14.7%的基因来自食道组织,其余的大部分是从表皮、免疫和消化代谢等相关组织中募集的,这些基因参与的功能通路都与瘤胃已知的功能高度相关。其次,通过比较骆驼、鲸豚和反刍动物的第一胃室的表达谱,发现它们与各自食道组织的表达最相似,三个类群第一胃室共享的基因参与表皮发育分化等功能。瘤胃相比其它物种的第一胃室表达上调427个基因,主要参与酮体代谢和调控微生物等功能相关通路。最后,胚胎期瘤胃与食道相比表达上调了285个差异基因,这些基因显著富集在表皮分化等功能。成熟期瘤胃相对其他组织高表达基因与胚胎期瘤胃相比食道表达上调的基因构成了846个瘤胃核心基因,这些基因反映了瘤胃从胚胎到成熟的功能并与塑造瘤胃的发育和进化过程有关。以上结果表明,瘤胃与鲸偶蹄目其他物种的第一胃室可能共享来自食道的发育起源,瘤胃不仅上调了食道表达的基因,还从其他组织募集了更多基因的表达,从而进化出增强的酮体代谢、不同的表皮结构和调控微生物定植的能力。2.通过反刍动物比较基因组得到的特异非编码保守元件和正选择基因的结果对瘤胃进化关键核心基因进行识别并进行功能验证。在846个瘤胃核心基因中,鉴定到657个附近有反刍动物特异保守非编码元件的基因和28个正选择基因,这些基因主要参与酮体代谢、角蛋白纤维锚定、细菌识别和皮肤屏障等生物学功能分类。大多数的(77.65%)瘤胃核心基因附近都有反刍动物特异非编码保守元件的分布,并部分地被瘤胃和食道的开放染色质区域验证。其中WDR66基因不仅具有反刍动物特异的氨基酸位点改变,并且与其他物种第一胃室、与食道相比,该基因在瘤胃中表达上调。其位于内含子的RSCNE与胚胎时期的瘤胃和食道差异峰重叠。通过构建含有该元件的荧光素酶报告载体并体外转染至绵羊和山羊的成纤维细胞进行荧光素酶活性检测,结果表明该元件具有增强子活性。在28个正选择基因中,受到正选择的酮体代谢通路关键限速酶基因HMGCS2发生了5个反刍动物特异的氨基酸位点改变,蛋白三维结构预测结果显示这些突变可能导致蛋白三维结构的改变。通过表达绵羊和人的5个反刍动物特异氨基酸位点正反向替换的蛋白并进行酶活性检测,结果显示反刍动物特异的氨基酸突变使得该蛋白比其他哺乳动物拥有更高的利用乙酰乙酰辅酶A合成羟甲基戊二酰辅酶A的酶活性。以上结果表明通过氨基酸突变和非编码调控元件改变的方式,瘤胃在进化过程中获得了增强的酮体代谢和上皮吸收能力。结果进一步证实调控改变是器官进化遗传机制中最活跃的方式,而蛋白编码区域的突变也是瘤胃关键功能创新进化中的重要遗传模式。3.获得了山羊出生后七个时间节点的瘤胃转录组和瘤胃内容物的宏基因组数据,并结合比较基因组分析结果,对早期瘤胃发育重编程的功能建立和微生物定植过程以及他们之间的功能互作关系进行探究。山羊断奶前瘤胃发育过程中,瘤胃的功能建立分为两个阶段,从d1到d14的免疫反应阶段和从d21到d56天的营养代谢阶段,微生物群落的演替则是从d7到d28的细菌素生物合成阶段和从d42到d56的糖酵解活性阶段。瘤胃基因功能的转换(第21天)要早于饲粮的介入(第25天)和微生物的阶段转换节点(第42天)。瘤胃基因转录谱在d14和d21之间的转变早于颗粒饲料的引入(d25)和微生物的转变(d28-d42)。通过加权基因共表达调控网络分析,瘤胃发育转录组和微生物宏基因组的表达动态谱分别鉴定出15个宿主基因模块和20个微生物属模块。宿主和微生物之间相关的功能主要包括瘤胃的pH稳态、氮代谢和免疫反应的生物学功能。反刍动物进化的两个新基因(DEFB1和LYZ1)在瘤胃发育过程中均在微生物阶段转换节点d42表达量达到最高,与此同时微生物的Alpha多样性指数在该时间点降到最低。通过表达山羊DEFB1和LYZ1蛋白,利用抑菌圈试验对这两个新基因进行抑菌能力检测,发现这两个新基因具有选择性抑制革兰氏阳性菌的活性。以上结果表明瘤胃的第一阶段的发育可能经历了不依赖于饲料和微生物刺激的程序化过程且瘤胃进化的新基因可能具有特异调控微生物群落的功能。综上,我们的研究探究了瘤胃在进化过程中的关键功能创新及涉及的多种遗传机制。本研究鉴定到的瘤胃核心基因及其特异突变为今后研究瘤胃发育基因调控网络,为了解瘤胃与微生物群之间的相互作用提供了一个起点。而这些将是进一步优化提高反刍家畜生产性能的关键,进而为操纵瘤胃发酵过程提供新的思路。