一、研究背景microRNA为22-24nt (nucleotide,核苷酸)的内源性非编码小RNA,目前已发现上千种,占已RNA的1%。它的功能多样,参与细胞增殖、分化、凋亡、进化等多方面调节。miRNA通过其种子序列(seed region)与靶向mRNA(信使RNA)结合,抑制靶向mRNA的翻译或者降解靶向mRNA。很多恶性肿瘤microRNA表达图谱表明,microRNA的表达水平存在失调现象。大量临床肿瘤病人标本检测再次证明了microRNA表达水平失调,目前已有充足证据证明microRNA正作为抑癌基因或者促癌基因参与肿瘤的形成、发生、发展。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin, mTOR)是整合细胞内外各种信号、调节细胞生长与代谢的中心信号分子,胰岛素、营养如氨基酸、葡萄糖、能量、生长因子、缺氧、应激等细胞内外的各种刺激通过mTOR与其他分子形成复合物,调节蛋白质翻译、脂类合成、线粒体能量代谢、细胞生长增殖、细胞骨架重组等生理过程。mTOR在细胞内与其它分子形成复合物才具有活性,目前发现有两种不同的mTOR复合物：mTORC1(mTOR complex 1)和mTORC2(mTOR complex 2)。最近有研究发现microRNAs也参与了mTOR的功能与调节,如1nTORC1可调节miR-1、miR-125b的表达,促进肌细胞的融合,而mTORC2特异性组成分子rictor可被miR-218负调控。但是mTOR所介导的促肿瘤细胞存活通路中,microRNA所起的作用尚不清楚。我们采用人乳腺癌MCF-7细胞系,给予rapamycin抑制mTORC1活性,PP242抑制mTORC1/2活性,24 h后进行microRNA表达谱芯片筛选,结果发现抑制mTORC1、mTORC2活性后,近百种nicroRNA的表达水平发生变化。其中,有10余种mciroRNA仅在mTORC2活性抑制后才发生改变。我们研究了其中的microRNA 9* (miR-9*),证实其受mTORC2而不是mTORC1负调节,并阐明了miR-9*促进肿瘤细胞凋亡的重要作用及其分子机制。二、研究结果1.mTOR酶抑制剂PP242而不是mTORC1特异抑制剂rapamycin可上调miR-9*表达。首先,给予MCF-7细胞以rapamycin 100 nM,PP242 200 nM处理24 h后,收取细胞标本进行microRNA芯片检测,得到MCF-7细胞中受药物PP242、 rapamycin调控的所有microRNA,其中有15种nicroRNA受PP242而非rapamycin调控,这表明,在MCF-7细胞系,存在仅受mTORC2而非mTORC1调控的microRNA。mTORC2可通过磷酸化Akt(S473)抑制细胞凋亡。我们接下来探讨仅受mTORC2调控的microRNA是否参与了mTORC2的促存活通路。将microRNA mimics分别转入MCF-7细胞中,我们发现,miR-9*能明显促进MCF-7细胞凋亡。采用qRT-PCR验证芯片结果：证实miR-9*仅受nTORC2调节。MCF-7细胞予PP242处理后,与对照组相比,miR-9*表达水平增加2.553±0.452倍(P<0.001);rapamycin 100 nM处理24 h后,miR-9*无显著变化。这些结果提示：mTORC2而不是mTORC1可负调节miR-9*表达。2.miR-9*促细胞凋亡。我们进一步探讨了miR-9*的功能。首先,将miR-9* mimics(类似物)转入MCF-7细胞后,采用qRT-PCR检测miR-9*表达水平,结果发现,miR-9*导入组比对照组表达水平高21.647±7.721倍(t=-4.632,P<0.05)。将不同浓度miR-9* mimics转染至MCF-7细胞72h后,与对照组相比,细胞数量显著降低(P<0.001)。血清饥饿后,对照组相比,miR-9*细胞凋亡率显著增加(P<0.0.001)。我们进一步探讨了miR-9*是否能促进化疗药物5-Fu的凋亡效应。给予不同浓度5-Fu μM、75μM、150μM处理24h后,与对照组相比较,5-Fu能导致miR-9*所诱导的MCF-7细胞凋亡率呈显著增加。(P<0.001)将miR-9* mimics 40nM转染至MDA-MB231细胞72h后,给予5-Fu 75μM24h,与对照组相比,凋亡率增加23.5%(P<0.001)。我们通过检测凋亡早期分子标志-剪接PARP(DNA修复酶,poly ADP-ribose polymerase)分子,也被miR-9* mimics显著上调。另外miR-9* mimics引发细胞凋亡、抑制细胞增殖的现象在肺癌细胞系A549、前列腺癌细胞系PC-3M中也得到了证实。因此,miR-9*可促进肿瘤细胞的凋亡。3.miR-9*靶标为E2F1(E2F1转录因子1, E2F transcription factor 1)。我们进一步探讨miR-9*引起细胞凋亡的机制。首先通过生物学分析软件,找出与凋亡相关的可能靶蛋白E2F1、E2F3、MDM2等。分别将预测靶蛋白的3’UTR区插入pMir-3’UTR-luciferase载体,与对照组相比,miR-9*降低pMir-3’UTR-E2F1荧光素酶表达量37.8±12.3%(P=0.005)。E2F1被报道具有促进或抑制凋亡的作用。我们进一步发现,将不同浓度miR-9* mimics转入MCF-7细胞后,发现E2F1的蛋白表达量呈浓度依赖性,依次递减。再次,将miR-9*抑制剂导入MCF-7细胞中,western blot结果表明,E2F1的蛋白表达量增加。在MDA-MB231中,也得到了相同结果。以上结果表明,miR-9*的靶标为E2F1。4.miR-9*通过抑制其靶蛋白E2F1介导了抑制mTORC2的促凋亡作用。首先,我们验证mTORC2而非mTORC1介导了细胞的凋亡作用。给予MCF-7细胞rapamycin 100nM、PP242 200nM处理48h后,与对照组相比,rapamycin组凋亡率无显著变化,PP242组凋亡率增加13.3±1.0%(P<0.001)。同时,与对照组相比,rapamycin组E2F1蛋白表达量无明显改变,而PP242组E2F1蛋白表达量显著降低。再次,采用siRNA-raptor干扰mTORC1复合体主要成分蛋白raptor,采用siRNA-rictor干扰InTORC2主要成分蛋白rictor,采用siRNA-mTOR干扰mTORCl & mTORC2复合体主要蛋白mTOR后,与对照组相比,si-rictor组、si-mTOR组E2F1蛋白表达水平下降,si-Raptor组E2F1蛋白表达水平则无明显变化；干扰48h,血清饥饿24h后,苔盼蓝染色后计数结果显示,si-rictor组、si-mTOR组细胞凋亡率增加21.0±3.1%,17.1±3。1%(P<0.001)。接下来我们探讨抑制miR-9*的表达之后,是否会逆转或部分逆转PP242的凋亡诱导作用。用miR-9*抑制剂(inhibitor)降低MCF-7细胞miR-9*表达水平24h后,给予PP242 100nM处理24h,与对照组相比,PP242组细胞凋亡率增加13.3±1.0%(P<0.001),而PP242+miR-9*抑制剂组细胞凋亡率并无明显变化。以上结果表明,miR-9* inhibitor可降低PP242所诱导的细胞凋亡率。为了进一步验证上述结果,我们观察cleaved-PARP分子的表达量变化,Western Blot结果表明,与ctrl组相比较,PP242组cleaved PARP表达量增加,PP242+miR-9* inhibitor组表达量无明显变化。5. Akt-DN升高miR-9*表达水平。MCF-7细胞过表达vector AKT-DN、AKT-CA质粒,36h后检测miR-9*表达水平。与对照组相比,Akt-DN组miR-9*表达水平显著升高。6.裸鼠皮下移植瘤模型显示,miR-9*可能通过靶蛋白E2F1介导mTORCl/2抑制剂PP242诱导凋亡的作用。我们采用裸鼠皮下移植瘤模型,给予裸鼠皮下注射MDA-MB231细胞系,同时每天喂食生理盐水、rapamycin、PP242,喂食14天后,PP242组的肿瘤面积、肿瘤重量明显低于生理盐水组、rapamycin组。TUNEL法显示,PP242组肿瘤细胞凋亡率显著高于生理盐水组及rapamycin组。其中与生理盐水组相比较,rapamycin裸鼠肿瘤内细胞凋亡率无明显改变。肿瘤组织RT-PCR结果显示,PP242组肿瘤细胞miR-9*表达水平高于对照组。Western blot结果表明,PP242组肿瘤组织E2F1蛋白表达水平低于对照组,而rapyamycin组肿瘤组织E2F1蛋白表达水平无明显改变。因此,体内实验进一步证明mTORC2而不是mTORC1可负调节miR-9*, miR-9*的靶点是E2F1。三、结论综上所述,我们建立了一条新的mTOR调节细胞存活／凋亡的信号通路：mTORC2-Akt-miR-9*-E2F1-apoptosis。miR-9*被mTORC2负调控,后者则可能通过靶向E2F1,促进细胞凋亡。这一结果为mTORC2调节细胞存活／凋亡的机制增添新的内容。同时,为miR-9*成为潜在的肿瘤治疗靶点提供依据。