研究背景肥胖症（obesity）是代谢性免疫紊乱引起一种慢性低强度炎症反应,脂肪（特别是内脏脂肪组织）堆积会导致脂肪组织局部的长期慢性炎症浸润,从而促进肥胖及其相关疾病的发生和发展。肥胖通常伴随诸如2型糖尿病、脂肪肝、心血管疾病等许多并发症的发生,其中脂肪组织、脂肪肝细胞和斑块分泌大量细胞因子包括TNF-α、IL-1β和单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）,进一步促进肥胖、脂肪肝、动脉粥样硬化和胰岛素抵抗的形成。单核细胞迁移因子（MCP-1）介导炎症细胞至损伤部位,在慢性炎症的浸润中发挥着重要的作用,是肥胖、脂肪肝、动脉粥样硬化与胰岛素抵抗等疾病发生发展的关键细胞因子。宾达利是一种MCP-1的特异性合成抑制剂,能减少炎症细胞在组织中的浸润,是一种非常具有潜力的新型抗炎药物,在类风湿关节炎、感染性肺炎、急性胰腺炎与肿瘤中都表现出较强的治疗作用。然而,由于宾达利在水中溶解度低,口服生物利用度较低,其治疗剂量极高,在小鼠中的有效剂量通常为每天200-400 mg/kg。对于需要长期用药的慢性疾病如肥胖,高剂量的用药在安全性与成本方面具有明显的劣势。由于MCP-1的炎症介导作用以通过这个策略实现炎症靶向,进而将药物浓集于靶区,从而减少用药剂量提高宾达利的临床应用潜力。经过近30年的快速发展,靶向给药系统已在肿瘤、动脉粥样硬化、关节炎、甚至是脑内疾病等多种具有明确病灶部位的疾病,表现出令人瞩目的靶向治疗效果。然而,针对例如肥胖症这种多病发灶的代谢综合症而言,要同时实现对全身多处病灶的靶向仍是靶向递送领域中的难点。单核细胞的募集几乎贯穿了肥胖相关性疾病发生发展的始终。无论是在炎性脂肪组织、脂肪肝局部或动脉粥样硬化的斑块中,都有明显的单核细胞募集现象。而本课题组过往长期关注于单核细胞靶向递送系统的设计与构建,在该领域中具有丰富的经验。前期已成功基于仿生酵母的胃肠道转运途径,通过以水不溶的β-1,3-D-葡聚糖为主要组成的酵母微囊,成功实现了类风湿关节炎、肿瘤与动脉粥样硬化的口服靶向治疗。酵母等微生物口服吸收与转移单核细胞中的主要机制,依赖于其细胞壁表面的β-1,3-D-葡聚糖,其可被肠道M细胞、单核细胞、DC细胞与巨噬细胞上的Dectin-1受体特异性的识别。因此,可利用单核细胞在肥胖症各个炎症病灶中的募集现象,通过胃肠道给药途径,将有望将宾达利经口服途径靶向递送至肥胖及其相关性疾病的多个病灶中。目的通过构建单核细胞作为转运体的具有特异性靶向的纳米递送系统,以实现同时靶向多个病灶。观察其是否对脂肪组织炎症、脂肪肝、胰岛素抵抗相关疾病等单核/巨噬细胞相关疾病的靶向治疗具有改善作用,并初步探讨该作用产生背后的机制,实现对肥胖及其相关疾病的多个病灶的靶向给药。方法1)通过计算机模拟、分子对接预测宾达利与聚乙烯亚胺的分子间作用及成药的可能性。2)通过透析法制备宾达利和聚乙烯亚胺纳米粒（pBIN）,采用红外光谱仪对制备的纳米粒进行验证。3)制备昆布多糖修饰的宾达利聚乙烯亚胺纳米粒（LApBIN）,对其表征及负载性能进行研究。4)采用Raw264.7细胞对昆布多糖修饰的宾达利纳米粒进行体外靶向机制研究。5)通过活体成像、共聚焦、体视荧光显微镜、免疫荧光染色、流式细胞分析等实验技术观察对荧光标记的纳米粒在胃肠道的靶向吸收及在外周血中的分布。6)通过活体成像、体视荧光显微镜、共聚焦、免疫荧光染色、免疫组化、ELISA实验和血液学相关指标分析等实验技术观察高脂饮食建立小鼠肥胖模型中LApBIN对脂肪组织的靶向及调控作用。7)通过活体荧光成像、体视荧光显微镜、共聚焦、免疫荧光染色、免疫组化、ELISA实验和血液学相关指标分析等技术观察LApBIN对脂肪肝的靶向及调控作用。8)肥胖诱导的胰岛素抵抗的治疗。通过对外周血TNF-α的浓度、血清胰岛素、血糖、胆固醇、甘油三脂、游离脂肪酸的水平进行检测来观察LApBIN对于胰岛素抵抗的作用。实验结果1)通过计算机模拟、分子对接发现宾达利和聚乙烯亚胺之间有比较强的结合力,主要是由氢键、静电作用、疏水的范德华力组成的。DPD介观模拟动力学分析宾达利和聚乙烯亚胺最终能够组装成纳米粒。2)经过24小时透析制备得到了粒径分布10.4±3.7 nm,表面电荷为37±2.6 mv的pBIN纳米粒。通过FT-IR进行表征介导PEI和BIN自组装的作用力。BIN在1624cm^-1和1380 cm^-1处的相对强吸收（分别对应于阴离子羧基的不对称和对称拉伸振动）与PEI形成纳米组装时显著减弱,表明它们之间存在静电相互作用。pBIN中羰基在1729 cm^-1和1624 cm^-1处的反对称拉伸振动消失,主要是由于pBIN中H键二聚体的破坏。由于芳基的存在,933 cm^-1和887 cm^-1处的吸光度明显减弱意味着这些疏水部分的缔合。3)将昆布多糖和宾达利纳米粒进行混合可以制备成昆布多糖修饰的正电荷纳米粒LApBIN。在TEM中LApBIN纳米粒与pBIN相比大小增加到112±8.3 nm,LApBIN的zeta电位显著降低。由于纳米粒中加入了LA,LApBIN的载药量低于pBIN载药量,但仍处于较高的载药量46.3±4.6%。在PBS中pBIN和LApBIN都能释放出BIN说明包封的BIN可以在体内释放。4)体外细胞实验发现Raw264.7细胞对昆布多糖修饰的宾达利纳米粒的摄取远高于普通纳米粒。检测Raw264.7巨噬细胞中宾达利的浓度实也发现Raw264.7摄取的LApBIN浓度远高于普通纳米粒,并可抑制MCP-1的表达。5)口服给予不同荧光标记的宾达利纳米粒后,通过活体成像和CLSM观察了纳米颗粒在肠道中的吸收和移位。给小鼠口服Cy5.5-pBIN和Cy5.5-LApBIN后4小时,在完全清洗内容物后,在活体成像系统下分离和观察这些小鼠的肠道组织。用Cy5.5-LApBIN处理的小鼠中分离出的肠道荧光远远高于Cy5.5-pBIN。Peyer’s Patch（肠道集合淋巴滤泡-一种肠相关淋巴组织）的荧光明显高于其他肠区。然后比较了单独拍摄荧光图像后,Peyer’s Patch的肠段与正常小肠的肠段,进一步阐明口服Cy5.5-LapBIN后,Peyer’s Patch中Cy5.5的分布远高于正常小肠,口服Cy5.5-pBIN后无显著性差异。口服Cy5.5-LApBIN 8 h后,外周血Cy5.5阳性率为10.02±4.82%,其中由Ly6C⁺单核细胞组成的Cy5.5阳性率为80.00±4.58%。6)肥胖小鼠口服Cy5.5标记的纳米粒后经活体荧光成像观察发现由于在炎性脂肪组织中LA有助于募集单核细胞的作用,口服治疗的小鼠中分离出的脂肪组织中Cy5.5-LApBIN荧光比Cy5.5-pBIN高得多,并且主要分布在CD68⁺巨噬细胞中,被有效地口服递送至炎性脂肪组织。切片实验中发现由于MCP-1在脂肪组织中表达降低,脂肪组织中炎性细胞因子TNF-α和IFN-γ的表达被抑制,CD68⁺巨噬细胞和CD8⁺T细胞也减少。游离BIN和pBIN对抑制MCP-1的表达,炎性细胞因子的分泌和炎性细胞的募集没有显示出显著影响。7)肥胖小鼠口服Cy5.5标记的纳米粒后经活体荧光成像观察发Cy5.5-LApBIN的小鼠肝脏中分离出的Cy5.5荧光明显高于Cy5.5-pBIN,这些Cy5.5-LApBIN主要分布在肝脏CD68⁺巨噬细胞中,而DIO小鼠肝脏切片中Cy5.5-pBIN处理的只观察到少量Cy5.5的荧光,这提示LApBIN具有良好的脂肪肝靶向性。由于LApBIN对脂肪肝的靶向作用,在LApBIN治疗的DIO小鼠肝脏中TNF-α和IFN-γ的促炎细胞因子的表达明显低于其他组的DIO小鼠。LApBIN处理的DIO小鼠中分离出的肝脏中油红染色的脂质和甘油三酯的浓度由于炎症的减少远低于其他DIO小鼠组。LApBIN组由于肝脏脂质堆积的减少,HE染色观察到的由脂质堆积引起的肝脏中空泡细胞的形成也明显减少。8)LApBIN对肥胖导致胰岛素抵抗的作用。LApBIN给药后降低了外周血中TNF-α、胰岛素、血糖、胆固醇、甘油三脂水平。实验结果表明LApBIN对胰岛素抵抗也有较好的治疗作用。研究结论本研究制备了具有靶向作用的纳米递送系统昆布多糖修饰的宾达利纳米粒（LApBIN）,可在单核/巨噬细胞表面的Dectin-1受体对昆布多糖β-1,3-D-葡聚糖的识别作用将纳米粒特异性浓集于单核/巨噬细胞。LApBIN经口服后进入肠内Peyer’s Patch部位的M细胞（membranous cell）内吞进入肠壁固有层,被其中的单核/巨噬细胞摄取并迁移至肠系膜淋巴结内,随后分布至淋巴循环内,然后分布到外周血中的Ly6C⁺单核细胞。Ly6C⁺单核细胞可以被有效地募集到炎症组织中,如炎症脂肪组织、脂肪肝病变和动脉粥样硬化斑块,进一步传递到炎症性脂肪组织、脂肪肝病变从而通过抑制这些病变中的炎症水平在肥胖和ORDs中发挥靶向治疗作用。