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背景感染是导致新生儿死亡的重要原因,住院患儿因免疫系统不成熟、使用广谱抗生素、接受侵入性外科操作等因素影响,容易发生医院获得性感染,尤其在新生儿重症监护病房(Neonatal Intensive Care Unit,NICU)内,医院获得性感染与患儿的发病率和死亡率显著相关。本实验室长期对我院就诊患者进行发热呼吸道症候群、发热出疹症候群和腹泻症候群病原谱的监测,其中80%为儿童,包括新生儿。在监测工作中发现,2019年5～7月集中检出来自我院NICU 7例埃可病毒11型(echovirus 11,EchoV 11)阳性样本。EchoV 11属于B组肠道病毒,多数致死性肠道病毒感染由EchoV 11所致。1977年至今,国外已报道多起新生儿病房内EchoV 11的暴发,死亡率高;国内目前多为散发病例,近年也开始出现新生儿院内感染的隐患,但尚未引起广泛关注。目前临床常用的EchoV 11检测方法是利用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增VP1区序列后进行测序鉴定,该方法检测周期较长(约2～3天),国内外目前还未有针对EchoV 11的快速分子检测方法报道。目的对我院NICU集中检出的EchoV 11感染阳性患儿进行临床特征和EchoV 11 VP1区基因特征分析,探究病例间的关联性以及病毒的进化来源,为EchoV 11不同基因型的流行情况提供参考。并在上述研究基础上,尝试建立针对EchoV 11 VP1区高敏感性、高特异性的荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR)方法,用于EchoV 11的快速检测,代替耗时长的传统VP1区扩增测序分型,以期实现对该病原引起的院内及社区获得感染进行快速、简便筛查及监测。方法1.对2013年1月1日至2019年12月31日我院NICU疑似肠道病毒感染的患儿采集肛拭子样本,筛选出非EV-A71/CV-A16的肠道病毒阳性样本,进行5’-UTR和VP1区扩增测序分型,对分型鉴定为EchoV 11阳性样本进行分离培养,扩增VP1区完整序列并测序。分析EchoV 11阳性患儿的临床特征,同时根据VP1区完整序列构建系统进化树,比较本研究分离株与国内外其他分离株的进化距离。2.参考近年国内流行的EchoV 11序列设计引物,建立针对EchoV 11 VP1区高敏感性、高特异性的qPCR方法,并构建重组质粒作为标准品,分析方法灵敏度、特异性、检测限和重复性。结果1.2019年5～7月检出来自我院NICU 6位患儿的7例EchoV 11阳性样本(9.7%),6位患儿均有气促、呼吸困难等临床表现。分离培养获得4株EchoV 11,核苷酸同源性97.9%～100.0%,氨基酸同源性99.0%～100.0%,均为D5亚型,与2019年广东省CDC分离的云浮株和顺德株高度同源。系统发育分析与国内其他地区2016年开始流行的D5亚型毒株进化距离相近;与国外分离株:AY121374.1(突尼斯1999年)、AY121375.1(荷兰2010年)、HG793702.1(法国2010年)和MN896926.1(美国2019年)属于同一分支,进化距离相近。2.本研究成功建立了适用于国内流行的EchoV 11 SYBR Green qPCR检测方法,扩增效率为84.0%,灵敏度、特异性分别为100.0%(95%CI:56.1%～100.0%)和98.7%(95%CI:91.8%～99.9%),检测下限为104～105copies/ml,检测结果变异系数为1.60%～4.73%。结论1.本研究分离的EchoV 11均为D5基因亚型,与近年我国其他D5亚型分离株同源性高。该亚型可能由荷兰、法国等地输入,并于近年开始在国内流行,可侵犯呼吸系统、神经系统,引起相应的呼吸道和神经系统症状。未来EchoV 11的流行趋势有待后续研究进一步分析。2.本研究成功建立了适用于国内流行的EchoV 11 SYBR Green qPCR检测方法,初步探究灵敏度、特异性和检测重复性均较好,但由于参与分析的样本量较少,检测性能评估不够全面,针对此类快速分子诊断方法的检测性能、应用前景,以及可否有效提高临床对感染患者的诊断效率,还有待后续相关研究进一步评估或改进。