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水稻纹枯病(Rice sheath blight disease, RSBD)是一种世界性水稻病害,同稻瘟病和白叶枯病一起被称为我国水稻的三大病害。目前,随着矮杆育种策略和高氮肥施肥方式的影响,该病已成为限制水稻高产、稳产的主要障碍之一,每年因为水稻纹枯病危害可导致水稻减产达数十亿公斤。特别是在高温、高湿条件下,使水稻减产10%到30%,严重时减产甚至超过50%,水稻纹枯病已成为我们南方水稻种植区的第一大水稻病害。立枯丝核菌Rhizoctonia solani AG-1IA是水稻纹枯病的致病病原菌,该菌在全世界范围内分布,寄主范围广,能侵害200多种不同的植物,可危害水稻、小麦、玉米、马铃薯、大豆、棉花、花生及其它重要经济作物。立枯丝核菌在自然情况下较难产生有性孢子,不产生无性孢子,存在多核现象。目前,关于立枯丝核菌的致病机制研究相对滞后。本研究拟通过农杆菌介导的T-DNA插入转化法获得国际标准菌株水稻纹枯病菌R. solani AG-1IA突变体,通过突变体的致病性的检测,以期寻找与病原菌致病性相关基因,并对功能基因进行相关分析,为进一步阐明病原菌的致病机制打下基础；同时,针对我国水稻纹枯病抗源材料匮乏的情况,本研究还对我国的水稻核心种质库材料进行纹枯病抗性材料的筛选和鉴定,为水稻育种提供有益材料资源。本研究主要结果为以下两个方面：1、立枯丝核菌R. solani AG-1IA突变体获得及分析(1)立枯丝核菌R. solani AG-1IA形态特征观察及潮霉素抗性检测将立枯丝核菌R. solani AG-1IA接种于PDA培养基上培养3天后,取部分菌丝于载玻片上,用棉酚蓝染色,观察到菌丝呈二叉分枝形态及菌丝融合现象。同时,用荧光染料DAPI染色观察后,观察到菌丝细胞中细胞核的个数为2-5个。将立枯丝核菌R. solani AG-1IA培养7天后形成的菌核在显微镜下,可观察到菌核形态为短杆状。将该菌活化后的菌丝接种到潮霉素浓度为Omg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L的PDA培养基上,可以观察到潮霉素浓度为20mg/L时,菌丝完全不能生长。(2)立枯丝核菌R. solani AG-1IA原生质体的制备及再生用酶解法制备原生质体,采用纤维素酶(10mg/ml)和崩溃酶(10mg/ml)组合处理12小时菌龄的菌丝,0.6M的硫酸镁(pH5.2)为渗透压稳定剂,35℃酶解3小时,可使每克菌丝产生1.67×109个原生质体。结果得出,原生质体再生的最优条件为：在再生培养基RM上,酶解2.5h,菌龄为16h的原生质体,以0.6M硫酸镁为渗透压稳定剂,26℃条件下培养时,再生效果最佳,再生率最高。(3)农杆菌介导的原生质体及菌丝的转化使用乙酰丁香酮(As)浓度为40mg/L预诱导5小时,此时农杆菌EHA105(内含质粒pCAMBIA1300)培养液OD值为0.5-0.8,农杆菌和原生质体浓度比为100：1,采用诱导培养基(IM),共培养温度为24℃,36h培养,利用1%半固体加潮霉素覆盖法筛选,转化效率最高。菌丝转化时,农杆菌培养液OD值为0.8,农杆菌和原生质体共培养温度为28℃,共培养时间为48h,转化效率最高。(4)立枯丝核菌(R. solani) AG-1IA突变体的致病性研究及菌丝融合分析通过农杆菌介导的原生质体及菌丝转化,经潮霉素筛选及分子水平验证得到120株阳性突变株。采用水稻9311分孽期倒二叶叶片,在人工智能气候培养箱中,28℃,湿度80%,培养24小时,以野生型IA作对照,观察接种T-DNA插入突变体进行致病性分析,得到了60个致病性减弱的突变体。同时通过菌丝融合分析,得到了27个菌丝不融合突变体,及3个菌丝部分融合突变体。(5) Son-PCR扩增侧翼序列通过单侧寡聚核苷酸嵌套PCR (single oligonucletide nested PCR)扩增立枯丝核菌(R. solai) AG-1IA突变体得到28个DNA序列与R. solani AG-1IA基因组上比对成功,其中得到2个菌丝不融合,1个致病性较弱且菌丝不融合,1个致病性减弱且菌丝部分融合共4个基因全长序列。得到的序列分别与AG-1IA-08162、 AG-1IA-08822、AG-1IA-0816、AG-1IA-036724个基因序列同源性100%。根据所比对的基因注释信息,其中,3个基因目前功能未知,1个基因为G蛋白调节因子2、水稻纹枯病抗性材料筛选与创制(1)水稻纹枯病抗性材料筛选种植水稻核心种质库185份水稻材料和9311突变体5份材料,取倒二叶叶片离体接种R. solani AG-1IA,在人工智能气候培养箱中,28℃,湿度80%,培养24小时,以水稻9311作对照,根据致病性检测,共筛选得到16份纹枯病抗性材料,62份纹枯病高感材料。(2)化学诱变剂EMS处理水稻创制抗性材料使用化学诱变剂EMS(甲基磺酸乙酯),配制0.05mol/L磷酸缓冲液和0.4%--0.5%EMS,设置4个不同的处理条件A、B、C、D分别处理水稻9311种子,播种后在海南得到自交突变体种子,将突变体种子种于温江实验田,取叶片离体接种R. solani AG-1IA进行致病性检测,经A和B条件处理的种子抗病性增强,C和D条件处理的种子抗病性没有变化。