研究背景及意义：支气管哮喘(简称哮喘)是最常见的慢性呼吸道炎症性疾病之一,研究显示,全球哮喘病人约3亿多,我国约有3000万,而且仍有不断增加的趋势。尽管通过全球哮喘防治创议(GINA)推荐的规范化治疗,大部分哮喘病人的临床症状可得到有效控制,但并不能抑制疾病潜在的发展,因此探讨哮喘的发病机制,进一步寻找治疗靶点具有重要的意义。气道上皮细胞(AEC)作为气道抵御外来环境刺激的第一道防线,在维持气道内环境的平衡和稳定中发挥重要的作用,在哮喘气道炎症的启动和维持中扮演关键角色。虽然支气管哮喘是以TH-2型炎症为主的气道慢性炎症炎症性疾病,但哮喘患者对外界过敏原刺激的高度敏感性及其疾病的进程却不能单纯用TH-2等免疫细胞介导的炎症的来解释,而近年来越来越多的研究表明气道上皮细胞等结构细胞可以感受外界的有害刺激,并在启动和维持哮喘炎症过程中发挥重要作用。有研究表明：哮喘患者存在气道上皮屏障功能受损,即气道上皮细胞连接蛋白的表达量减少或分布异常。继上皮细胞屏障功能被屋尘螨、花粉、真菌等过敏原破坏后,通过上皮细胞分泌各种炎性因子及过敏原穿过受损的上皮屏障与上皮下DC等免疫细胞接触等过程,共同激活免疫细胞而促发炎症级联反应,与此同时,气道上皮细胞还分泌许多细胞因子促进粘液分泌、基底膜增厚、平滑肌细胞增生等诱导气道重塑,从而引起更强更持久的慢性炎症反应,最终导致哮喘病程过程的不可逆转。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)家族主要包括VEGF-A、B、C、D、E、F,其中研究最多的是VEGF-A,人VEGF-A基因由8个外显子和7个内含子组成,其mRNA以不同方式剪切形成5种同分异构体(VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206)。多数情况下,VEGF165的表达占优势,是发挥生物学效应的主要成分。国内外研究中的VEGF,若未特殊说明,均指VEGF165。VEGF的功能复杂,它能促血管生成、增加血管的通透性及血管重塑,也可促进受损组织修复及保护组织细胞。国内外大量研究发现相对于正常人,哮喘患者的诱导痰和支气管肺泡灌洗液中VEGF浓度明显升高,并且其升高水平与疾病严重程度密切相关。之后的动物研究发现干扰VEGF作用后,TDI-哮喘小鼠的哮喘症状及气道炎症明显缓解。而相对于正常小鼠,过表达VEGF的小鼠出现了明显的哮喘样症状。这些动物实验提示VEGF在哮喘发病过程有重要作用。进一步的研究表明VEGF通过活化气道上皮下的DC参与到Th2细胞炎症中,同时它还可诱发粘膜化生,气道重塑及气道高反应性等。这些研究进一步证实了VEGF在支气管哮喘发生发展过程中起着关键性作用,而这一作用很可能是通过调控气道炎症介导的。此外,有研究表明VEGF介导了蟑螂提取物、花粉等常见过敏原诱导的气道上皮屏障破坏,我们实验室既往研究也表明：在体外试验中, TDI-HSA复合物或屋尘螨可引起气道上皮细胞系(16HBE)或人气道原代上皮细胞通透性的增加,该通透性的改变与VEGF的释放有关。但VEGF是否可直接破坏气道屏障功能及气道上皮细胞间连接蛋白,进而启动和促发气道炎症目前尚不清楚。糖皮质激素成为哮喘治疗的一线药物,是由于其强大的抗炎作用,糖皮质激素可以减轻炎症细胞浸润及抑制多种炎症因子的表达,例如,它可以通过作用于气道上皮细胞的糖皮质激素受体,抑制气道上皮细胞释放多种炎症因子,近期研究亦表明糖皮质激素可通过EGFR受体途径作用气道上皮细胞,引起正常状态下气道上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1等重新分布,有增强上皮间屏障功能的作用。但是在损伤状态下,糖皮质激素是否具有上皮屏障修复作用尚不清楚。因此探讨致敏状态或损伤状态下,糖皮质激素对气道上皮细胞屏障功能的保护作用非常重要和必要,这可能为糖皮质激素运用于哮喘治疗提供新的证据,同时为哮喘的治疗找到新的治疗靶点。本研究拟在体外实验证明重组人VEGF165对呼吸道上皮屏障功能的影响,进一步探讨糖皮质激素在其中的干预作用及可能的作用机制。课题第一部分：血管内皮生长因子(VEGF)对人支气管上皮细胞株16HBE-14o和人肺腺癌细胞株A549屏障功能的影响研究方法：1、四唑盐(MTT)比色法检测不同浓度的VEGF对16HBE细胞(或A549细胞)活力的影响。分组情况：正常对照组(不加VEGF,只以无血清培养基孵育),VEGF10ng/ml、VEGF50ng/ml、VEGF100ng/ml、VEGF150ng/ml(n=8)。按上述分组刺激细胞24h后,用MTT比色法检测细胞活力。2、观察VEGF50ng/ml在不同时间点对16HBE细胞(或A549细胞)屏障功能的影响。分组情况：正常对照组(不加VEGF,只以无血清培养基孵育),VEGF30分钟组,VEGF2小时组,VEGF6小时组,VEGF12小时组,VEGF24小时组(n=6)。按上述分组刺激细胞后,行细胞跨膜电阻测定及FITC-右旋糖酐检测细胞层的通透性。3、观察VEGF50ng/ml在不同时间点对16HBE细胞(或A549细胞)紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、claudin-2)和粘附连接蛋白(E-Cadherin、p-Catenin)表达的影响。分组情况：正常对照组(不加VEGF165只以无血清培养基孵育),VEGF30分钟组,VEGF2小时组,VEGF6小时组,VEGF12小时组,VEGF24小时组(n=8)。按上述分组刺激细胞后,行Western blot检测ZO-1、E-Cadherin等蛋白总的表达水平。4、观察VEGF50ng/ml对16HBE细胞(或A549细胞)粘附连接蛋白(E-Cadherin、β-Catenin)分布的影响。分组情况：正常对照组(不加VEGF165只以无血清培养基孵育),VEGF6小时组(n=4)。按上述分组刺激细胞后,行免疫荧光检测E-Cadherin、β-Catenin蛋白的分布情况。统计学方法：采用SPSS13.0统计软件分析,计量资料用均数±标准差表示,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用LSD法,方差不齐时总体均数的比较采用Welkch法,各组间多重比较采用Tamhane’s T2检验,以P<0.05具有统计学意义。结果：1、不同浓度VEGF对16HBE细胞(或A549细胞)活力的影响：VEGF浓度为10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml时对细胞活力均无显著影响(P=0.23)；VEGF浓度为150ng/ml时显著抑制细胞活力(P<0.05)。2、VEGF50ng/ml在不同时间点对16HBE细胞(或A549细胞)屏障功能的影响：细胞跨膜电阻及FITC-右旋糖酐透过率显示：相对于正常对照组,50ng/mlVEGF刺激16HBE细胞30分钟、2小时、6小时、12小时、24小时均可显著增加细胞层的通透性(P<0.05),以50ng/mlVEGF刺激6小时细胞通透性增加最显著(P<0.01)；相对于正常对照组,50ng/mlVEGF刺激A549细胞30分钟、2小时、6小时、12小时、24小时均可显著增加细胞层的通透性(P<0.05),并呈时间依赖,以50ng/mlVEGF刺激24小时细胞通透性增加最显著(P<0.01)。3、VEGF50ng/ml在不同时间点对16HBE细胞(或A549细胞)紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、claudin-2)和粘附连接蛋白(E-Cadherin、β-Catenin)表达的影响：Western blot所见,各组ZO-1、Occludin、claudin-2、E-Cadherin、 β-Catenin总表达量无明显改变(P>0.05)。4、VEGF50ng/ml对16HBE细胞(或A549细胞)粘附连接蛋白(E-Cadherin、 β-Catenin)分布的影响：免疫荧光显示：在正常16HBE细胞(或A549细胞),E-Cadherin和β-Catenin多沿胞膜连续分布于细胞间连接处,VEGF50ng/ml处理6小时后,细胞间连接处E-Cadherin和β-Catenin的完整性遭到破坏,向胞浆中弥散增多。结论：1、VEGF可显著破坏16HBE细胞和A549细胞的屏障功能。2、VEGF可显著诱导16HBE细胞和A549细胞E-钙粘蛋白及p-环连蛋白分布的改变。但对E-钙粘蛋白、p-环连蛋白、ZO-1、Occludin及claudin-2蛋白的总表达量无显著影响。课题第二部分：VEGF通过活化P13K通路和JNK通路破坏人支气管上皮细胞株16HBE-14o的屏障功能研究方法：1、观察VEGF50ng/ml在不同时间点对16HBE细胞信号通路分子(P13K、JNK等)的活化。分组情况：正常对照组(不加VEGF,只以无血清培养基孵育),VEGF5分钟组,VEGF10分钟组,VEGF15分钟组,VEGF30分钟小时组,VEGF1小时组,VEGF2小时组,VEGF6小时组(n=6)。按上述分组刺激细胞后,行Western blot检测PI3K、JNK等信号蛋白的总水平及磷酸化水平。2、观察P13K(或JNK或Erk)通路抑制剂LY294002(或SP600125或U0126)对、VEGF活化的PI3K、JNK及Erk通路蛋白的影响。分组情况：正常对照组(不加VEGF,只以无血清培养基孵育),VEGF50ng/ml30分钟组,LY294002(或SP600125或U0126)预处理1小时后VEGF50ng/ml30分钟组,LY294002(或SP600125或U0126)组(n=6)。按上述分组刺激细胞后,行Western blotting检测PI3K、JNK及Erk信号蛋白的总水平及磷酸化水平。3、观察PI3K(或JNK或Erk)通路抑制剂LY294002(或SP600125或U0126)对VEGF所致气道上皮屏障破坏的影响。分组情况：正常对照组(不加VEGF,只以无血清培养基孵育),VEGF50ng/ml6小时组,LY294002(或SP600125或U0126)预处理1小时后VEGF50ng/ml6小时组,LY294002(或SP600125或U0126)组(n=4)。按上述分组刺激细胞后,行细胞跨膜电阻测定及FITC-右旋糖酐检测细胞层的通透性。4、观察P13K(或JNK或Erk)通路抑制剂LY294002(或SP600125或U0126)对VEGF引起的E-Cadherin和β-Catenin蛋白破坏是否具有保护作用。分组情况：正常对照组(不加VEGF,只以无血清培养基孵育),VEGF50ng/ml6小时组,LY294002(或SP600125或U0126)预处理1小时后VEGF50ng/ml6小时组,LY294002(或SP600125或U0126)组(n=4)。按上述分组刺激细胞后,行免疫荧光检测E-Cadherin、β-Catenin蛋白的分布情况。5、统计学方法：采用SPSS13.0统计软件分析,计量资料用均数±标准差表示,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用LSD法,方差不齐时总体均数的比较采用Welkch法,各组间多重比较采用Tamhanes T2检验,以P<0.05具有统计学意义。结果：1、VEGF50ng/ml在不同时间点对16HBE细胞信号通路分子(PI3K、JNK等)的活化：Western blotting所见,相对于正常对照组,VEGF刺激16HBE15分钟、30分钟后,p-Akt、p-JNK及p-Erk蛋白表达显著增加(P<0.05)。2、P13K(或JNK或Erk)通路抑制剂LY294002(或SP600125或U0126)对VEGF活化的PI3K、JNK及Erk通路蛋白的影响：Western blotting所见,相对于VEGF组,LY294002(或SP600125或U0126)预处理后VEGF组的p-Akt(或p-JNK或p-Erk)蛋白表达显著降低(P<0.05)。3、P13K(或JNK或Erk)通路抑制剂LY294002(或SP600125或U0126)对VEGF所致气道上皮屏障破坏的影响：细胞跨膜电阻及FITC-右旋糖酐透过率显示：相对于VEGF处理组,LY294002(或SP600125)预处理后VEGF组的细胞屏障功能可部分恢复(P<0.05),U0126预处理后VEGF组的细胞屏障功能无明显改变(P>0.05)。4、P13K(或JNK或Erk)通路抑制剂LY294002(或SP600125或U0126)对VEGF引起的E-Cadherin和β-Catenin蛋白破坏的影响：免疫荧光显示,相对于VEGF处理组,LY294002(或SP600125)预处理后VEGF组E-钙粘蛋白和p-环连蛋白的分布及结构改变可部分被逆转,U0126预处理后VEGF组E-钙粘蛋白和p-环连蛋白的分布及结构改变无明显差异。结论：VEGF可诱导气道上皮细胞株16HBE的PI3K、JNK及Erk信号通路活化。而PI3K或JNK通路抑制剂(LY294002或SP600125)可部分逆转VEGF所致的VEGF所致的上皮细胞屏障功能的破坏和E-钙粘蛋白、p-环连蛋白分布改变。这也提示VEGF可通过P13K和JNK信号通路调节E-钙粘蛋白和p-环连蛋白的分布,从而发挥破坏气道上皮细胞屏障的作用。课题第三部分：地塞米松通过PI3K通路减少VEGF所致的气道上皮屏障破坏研究方法：1、观察地塞米松对VEGF引起的16HBE细胞(或A549细胞)屏障破坏是否有保护作用。分组情况：正常对照组(不加VEGF,只以无血清培养基孵育),VEGF50ng/ml6小时组,地塞米松10-4M预处理后VEGF50ng/ml6小时组,地塞米松10-4M处理组(n=5)。上述分组刺激细胞后,行细胞跨膜电阻测定及FITC-右旋糖酐检测细胞层的通透性。2、观察地塞米松对VEGF所致的E-钙粘蛋白和p-环连蛋白破坏是否有保护作用。分组情况：正常对照组(不加VEGF,只以无血清培养基孵育),VEGF50ng/ml6小时组,地塞米松10-4M预处理后VEGF50ng/ml6小时组,地塞米松10-4M处理组(n=4)。上述分组刺激细胞后,行免疫荧光检测E-Cadherin、β-Catenin蛋白的分布情况。3、观察地塞米松能否抑制VEGF诱导的PI3K(或JNK)活化。分组情况：正常对照组(不加VEGF,只以无血清培养基孵育),VEGF50ng/ml6小时组,地塞米松10-4M预处理后VEGF50ng/ml6小时组,地塞米松10-4M处理组(n=7)。上述分组刺激细胞后,行Western blotting检测PI3K、JNK蛋白的总水平及磷酸化水平。4、统计学方法：采用SPSS13.0统计软件分析,计量资料用均数±标准差表示,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用LSD法,方差不齐时总体均数的比较采用Welkch法,各组间多重比较采用Tamhane’s T2检验,以P<0.05具有统计学意义。结果：1、地塞米松对VEGF引起的16HBE细胞屏障破坏的影响：细胞跨膜电阻及FITC-右旋糖酐透过率显示：相对于VEGF处理组,地塞米松预处理后VEGF组的上皮细胞屏障功能可部分恢复(P<0.05),相对于正常对照组,地塞米松处理组的上皮细胞屏障功能无显著改变(P>0.05)。2、地塞米松对VEGF所致的E-钙粘蛋白和p-环连蛋白破坏的影响：免疫荧光显示,相对于VEGF处理组,地塞米松预处理后VEGF组的E-钙粘蛋白和p-环连蛋白分布减少、排列紊乱及向胞浆内弥散等情况可部分恢复。3、地塞米松对VEGF活化PI3K(或JNK)的影响：Western blotting所见,相对于VEGF处理组,地塞米松预处理后VEGF组的p-Akt蛋白表达显著减少(P<0.05),地塞米松预处理后VEGF组的p-JNK蛋白表达无明显变化(P>0.05)。结论：1、地塞米松可通过PI3K信号通路部分修复VEGF所致16HBE细胞的屏障破坏,这一效应是通过恢复E-钙粘蛋白和p-环连蛋白的结构完成的。3、短时间内地塞米松对16HBE细胞屏障功能无保护作用。