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第一部分表达存活素(Survivin)和端粒酶(TERT)融合蛋白的重组痘苗病毒的构建及体外抗肿瘤作用
背景
目前，对大多数恶性肿瘤尚难做到早期诊断，病人在确诊时大多已属中晚期。即使在确诊时无临床转移证据的病人，在经单纯局部治疗后，50%仍会发生远处转移，因此，大部分病人需要综合治疗。为了消除肿瘤对人类的危害，肿瘤疫苗的探索从未停止。在HPV疫苗上市后肿瘤疫苗的研发日益受到人们的重视，与传统的治疗手段相比，肿瘤的疫苗具有靶向性高，副反应小的特点。病毒载体肿瘤疫苗是将携带编码肿瘤抗原、共刺激分子或者细胞因子基因的病毒，当这些病毒注射后，在体内可以诱导针对肿瘤的免疫应答。以痘苗病毒为载体的治疗性肿瘤疫苗是一种新颖有效的策略。
试验目的
设计并构建表达目的基因的重组痘苗病毒，探索重组痘苗病毒的抗肿瘤作用和复制能力。
试验方法
设计并构建表达鼠源存活素T34A突变体(mSurvivin-T34A mutant)、鼠源端粒酶(mTERT)、鼠源存活素-端粒酶融合蛋白(mSurT34A-TERT)的真核载体质粒，并转染-感染至野生型痘苗病毒中。采用PCR和WesternBlot分别对表达mSurvivin-T34A、mTERT、mSur-TERT的重组痘苗病毒进行鉴定，CCK-8检测野生型痘苗病毒和重组痘苗病毒对不同肿瘤细胞系的杀伤作用，结晶紫染色检测重组痘苗病毒在不同细胞系中的复制能力。
结果
PCR结果显示，重组痘苗病毒基因组中成功插入对应的外源性基因，WesternBlot结果显示，重组痘苗病毒均表达对应的目的蛋白。CCK-8结果显示，相比于正常细胞，病毒对肿瘤细胞有更加明显的杀伤作用；结晶紫染色结果显示，相比于正常细胞，病毒在肿瘤细胞系和工具细胞中有更好的复制能力。
结论
本研究成功构建了表达mSur-T34A蛋白、mTERT蛋白及mSurT34A-TERT融合蛋白的重组痘苗病毒，并在体外试验中验证了重组痘苗病毒在肿瘤细胞系中的复制能力和杀伤作用，为后续动物实验提供了理论基础。
第二部分重组痘苗病毒对小鼠恶性肿瘤治疗作用的可能机制探索及临床意义
背景
目前，包括GL-ONC1和JX594等以痘苗病毒为载体的人工改造病毒已经进入临床试验阶段，并取得了满意的结果。JX-594是以Wyeth株或Copenhagen株为载体，插入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)并失活胸苷基因(TK)的重组痘苗病毒。GL-ONC1是一种减毒的Lister株，分别用荧光素酶-绿色荧光蛋白融合蛋白，β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶代替F14.5L，J2R(编码胸苷激酶)和A56R(编码红血球凝集素)重组进入亲本病毒Lister株基因组中。但研究报道，Lister株和Wyeth株的体外溶瘤效果弱于WR(Western Reverse)株。以痘苗病毒WR株为载体，构建重组痘苗病毒治疗恶性肿瘤的研究却极少报道。
试验目的
探索以痘苗病毒WR株为载体的重组溶瘤病毒在小鼠体内的安全性和病毒代谢情况，并利用小鼠恶性肿瘤的皮下移植瘤模型，探索重组痘苗病毒对小鼠恶性肿瘤的治疗作用。
试验方法
选取野生型C57雌性小鼠，选用不同滴度的痘苗病毒注射无荷瘤小鼠，观察小鼠一般情况和生存情况，分别在注射后24、72、12、168小时对小鼠行安乐死，并取大脑、肝脏、卵巢、腹腔渗出液检测病毒滴度。构建小鼠恶性黑色素瘤(B16)的皮下移植瘤模型，后随机分组成PBS组、vv-MCZ组、vv-Sur-T34A组、vv-mTERT组、vv-Sur-F2A-mTERT组和vv-Sur-Nd2-mTERT组，腹腔注射对应的重组痘苗病毒并测量肿瘤的大小及记录小鼠生存情况，注射后第30天安乐死部分小鼠，取肿瘤组织测滴度及称重。构建小鼠皮下移植瘤模型，随机分组后腹腔注射重组痘苗病毒，分别在注射后的第3、6天安乐死小鼠，取部分肿瘤组织检测病毒募集淋巴细胞情况，取部分脾脏细胞检测效细胞毒性淋巴细胞反应，并结合免疫耗竭试验明确溶瘤病毒的抗肿瘤机制。
结果
痘苗病毒WR株的安全性试验结果显示：痘苗病毒的主要毒副作用为体重下降，小鼠可耐受高剂量的重组痘苗病毒，野生型痘苗病毒对野生型C57小鼠的致死剂量约为5×107pfu，在小鼠无肿瘤负荷的情况下，腹腔渗出液中的病毒滴度显著低于注射的病毒滴度，肝组织中的病毒衰减迅速，在168小时内完全清除，脑组织中病毒滴度几乎为零，在卵巢组织中野生型痘苗病毒在卵巢组织中显示了比重组痘苗病毒更强的复制能力。用重组痘苗病毒对荷瘤小鼠进行治疗，结果显示：重组痘苗病毒可持续在肿瘤组织中复制，表达融合基因的重组痘苗病毒的治疗效果优于表达单个基因的重组痘苗病毒，单基因表达的重组痘苗病毒治疗效果优于空白载体的重组痘苗病毒。流式结果提示重组痘苗病毒可激活机体免疫功能，其可诱导肿瘤组织募集大量T淋巴细胞；通过细胞毒性淋巴细胞活性检测及免疫耗竭试验发现CD8+T淋巴细胞在重组痘苗病毒抗肿瘤中的作用。
结论
表达融合Survivin-TERT基因的重组痘苗病毒，能够显著降低小鼠的肿瘤负荷，并延长小鼠的生存时间，同时刺激小鼠自体的免疫，产生协同抗肿瘤作用。
背景
目前，对大多数恶性肿瘤尚难做到早期诊断，病人在确诊时大多已属中晚期。即使在确诊时无临床转移证据的病人，在经单纯局部治疗后，50%仍会发生远处转移，因此，大部分病人需要综合治疗。为了消除肿瘤对人类的危害，肿瘤疫苗的探索从未停止。在HPV疫苗上市后肿瘤疫苗的研发日益受到人们的重视，与传统的治疗手段相比，肿瘤的疫苗具有靶向性高，副反应小的特点。病毒载体肿瘤疫苗是将携带编码肿瘤抗原、共刺激分子或者细胞因子基因的病毒，当这些病毒注射后，在体内可以诱导针对肿瘤的免疫应答。以痘苗病毒为载体的治疗性肿瘤疫苗是一种新颖有效的策略。
试验目的
设计并构建表达目的基因的重组痘苗病毒，探索重组痘苗病毒的抗肿瘤作用和复制能力。
试验方法
设计并构建表达鼠源存活素T34A突变体(mSurvivin-T34A mutant)、鼠源端粒酶(mTERT)、鼠源存活素-端粒酶融合蛋白(mSurT34A-TERT)的真核载体质粒，并转染-感染至野生型痘苗病毒中。采用PCR和WesternBlot分别对表达mSurvivin-T34A、mTERT、mSur-TERT的重组痘苗病毒进行鉴定，CCK-8检测野生型痘苗病毒和重组痘苗病毒对不同肿瘤细胞系的杀伤作用，结晶紫染色检测重组痘苗病毒在不同细胞系中的复制能力。
结果
PCR结果显示，重组痘苗病毒基因组中成功插入对应的外源性基因，WesternBlot结果显示，重组痘苗病毒均表达对应的目的蛋白。CCK-8结果显示，相比于正常细胞，病毒对肿瘤细胞有更加明显的杀伤作用；结晶紫染色结果显示，相比于正常细胞，病毒在肿瘤细胞系和工具细胞中有更好的复制能力。
结论
本研究成功构建了表达mSur-T34A蛋白、mTERT蛋白及mSurT34A-TERT融合蛋白的重组痘苗病毒，并在体外试验中验证了重组痘苗病毒在肿瘤细胞系中的复制能力和杀伤作用，为后续动物实验提供了理论基础。
第二部分重组痘苗病毒对小鼠恶性肿瘤治疗作用的可能机制探索及临床意义
背景
目前，包括GL-ONC1和JX594等以痘苗病毒为载体的人工改造病毒已经进入临床试验阶段，并取得了满意的结果。JX-594是以Wyeth株或Copenhagen株为载体，插入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)并失活胸苷基因(TK)的重组痘苗病毒。GL-ONC1是一种减毒的Lister株，分别用荧光素酶-绿色荧光蛋白融合蛋白，β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶代替F14.5L，J2R(编码胸苷激酶)和A56R(编码红血球凝集素)重组进入亲本病毒Lister株基因组中。但研究报道，Lister株和Wyeth株的体外溶瘤效果弱于WR(Western Reverse)株。以痘苗病毒WR株为载体，构建重组痘苗病毒治疗恶性肿瘤的研究却极少报道。
试验目的
探索以痘苗病毒WR株为载体的重组溶瘤病毒在小鼠体内的安全性和病毒代谢情况，并利用小鼠恶性肿瘤的皮下移植瘤模型，探索重组痘苗病毒对小鼠恶性肿瘤的治疗作用。
试验方法
选取野生型C57雌性小鼠，选用不同滴度的痘苗病毒注射无荷瘤小鼠，观察小鼠一般情况和生存情况，分别在注射后24、72、12、168小时对小鼠行安乐死，并取大脑、肝脏、卵巢、腹腔渗出液检测病毒滴度。构建小鼠恶性黑色素瘤(B16)的皮下移植瘤模型，后随机分组成PBS组、vv-MCZ组、vv-Sur-T34A组、vv-mTERT组、vv-Sur-F2A-mTERT组和vv-Sur-Nd2-mTERT组，腹腔注射对应的重组痘苗病毒并测量肿瘤的大小及记录小鼠生存情况，注射后第30天安乐死部分小鼠，取肿瘤组织测滴度及称重。构建小鼠皮下移植瘤模型，随机分组后腹腔注射重组痘苗病毒，分别在注射后的第3、6天安乐死小鼠，取部分肿瘤组织检测病毒募集淋巴细胞情况，取部分脾脏细胞检测效细胞毒性淋巴细胞反应，并结合免疫耗竭试验明确溶瘤病毒的抗肿瘤机制。
结果
痘苗病毒WR株的安全性试验结果显示：痘苗病毒的主要毒副作用为体重下降，小鼠可耐受高剂量的重组痘苗病毒，野生型痘苗病毒对野生型C57小鼠的致死剂量约为5×107pfu，在小鼠无肿瘤负荷的情况下，腹腔渗出液中的病毒滴度显著低于注射的病毒滴度，肝组织中的病毒衰减迅速，在168小时内完全清除，脑组织中病毒滴度几乎为零，在卵巢组织中野生型痘苗病毒在卵巢组织中显示了比重组痘苗病毒更强的复制能力。用重组痘苗病毒对荷瘤小鼠进行治疗，结果显示：重组痘苗病毒可持续在肿瘤组织中复制，表达融合基因的重组痘苗病毒的治疗效果优于表达单个基因的重组痘苗病毒，单基因表达的重组痘苗病毒治疗效果优于空白载体的重组痘苗病毒。流式结果提示重组痘苗病毒可激活机体免疫功能，其可诱导肿瘤组织募集大量T淋巴细胞；通过细胞毒性淋巴细胞活性检测及免疫耗竭试验发现CD8+T淋巴细胞在重组痘苗病毒抗肿瘤中的作用。
结论
表达融合Survivin-TERT基因的重组痘苗病毒，能够显著降低小鼠的肿瘤负荷，并延长小鼠的生存时间，同时刺激小鼠自体的免疫，产生协同抗肿瘤作用。